Metabolic engineering for the production of isoprene and isopentenol by Escherichia coli
- 作者
- Meijie Li, Rui Nian, Mo Xian, Haibo Zhang
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2018）
- DOI
- 10.1007/s00253-018-9200-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用大肠杆菌细胞工厂实现异戊二烯和异戊烯醇的可持续生物合成，以替代依赖石油的化学合成方法，并解决相关环境问题
研究策略
系统综述了大肠杆菌中生产异戊二烯和异戊烯醇的代谢工程策略，包括异戊二烯合酶（IspS）的筛选与定向进化、磷酸酶的选择、天然MEP途径与异源MVA途径的改造、前体支持的优化等
研究路线图
核心内容
该研究系统综述了利用大肠杆菌生产异戊二烯和异戊烯醇的代谢工程策略。作者聚焦近两年进展，围绕异戊二烯合酶（IspS）筛选与定向进化、MEP与MVA途径协同改造、前体优化等展开梳理。通过敲除副产物途径，异戊二烯最高产量达1832 mg/L；采用枯草芽孢杆菌DXS和DXR可使产量达314 mg/L（为天然酶过表达菌株的2倍），而MEP与MVA途径协同使产量分别比单独途径提高约20倍和3倍。酶工程方面，IspS定点突变L494和K272R分别使酶活提高约2倍和1.8–2倍，定向进化带来3倍产量提升；HMGS A110G突变使酶促反应提高140倍，异戊二烯产量增加2.3倍。在异戊烯醇方面，5-L发酵产量为61.9 mg/L，受磷酸酶活性限制。结果表明大肠杆菌仍是生产这两种化合物的主要底盘，但异戊烯醇生产需筛选更强磷酸酶或构建截短MVA途径，同时探索新型代谢途径与其他宿主具有潜力。
创新点
系统总结了近期（尤其近两年）异戊二烯和异戊烯醇生物合成的研究进展，首次对异戊烯醇生物生产进行综述；归纳了IspS酶工程、MEP/MVA途径协同、新途径构建（如OleT介导途径）等创新策略
研究对象（19）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP途径 | dxs | DXS | 催化 | DXP合酶，MEP途径关键限速酶，催化丙酮酸和G3P缩合生成DXP |
| Escherichia coli | MEP途径 | dxr (ispC) | DXR | 催化 | DXP还原异构酶，MEP途径另一个限速酶 |
| Escherichia coli | MEP途径 | ispG (gcpE) | IspG | 催化 | HMBPP合酶，含[4Fe-4S]簇，需要氧化还原穿梭蛋白 |
| Escherichia coli | MEP途径 | ispH (lytB) | IspH | 催化 | HMBPP还原酶，含[4Fe-4S]簇 |
| Escherichia coli | MEP/MVA途径 | idi | IDI | 催化 | 异戊烯基二磷酸异构酶，催化IPP和DMAPP互变，过表达可提高异戊二烯/类胡萝卜素产量 |
| Escherichia coli | MVA途径 | atoB | ACCT | 催化 | 乙酰CoA乙酰转移酶，催化乙酰CoA→乙酰乙酰CoA |
| Escherichia coli | MVA途径 | mvaS | HMGS | 催化 | HMG-CoA合酶，A110G突变使酶活提高140倍，异戊二烯产量提高2.3倍 |
| Escherichia coli | MVA途径 | mvaE | HMGR | 催化 | HMG-CoA还原酶，MVA途径限速酶，来自粪肠球菌的上游途径效果优于酿酒酵母 |
| Escherichia coli | MVA途径 | mvk | MK | 催化 | 甲羟戊酸激酶，受下游产物反馈抑制；来自Methanosarcina mazei的MK抗反馈抑制，额外表达使异戊二烯提高5倍 |
| Escherichia coli | MVA途径 | oleT | OleTJE | 催化 | 脂肪酸脱羧酶，新途径将MVA直接转化为异戊烯醇 |
| Escherichia coli | MVA途径 | ohyA | OhyAEM | 催化 | 油酸水合酶，新途径将异戊烯醇转化为异戊二烯 |
| Escherichia coli | 异戊烯醇合成 | nudB | EcNudB | 催化 | 大肠杆菌Nudix水解酶，偏好DMAPP去磷酸化，与IDI融合可提高前醇产量 |
| Escherichia coli | 异戊烯醇合成 | nudF (yhjR) | BsNudF | 催化 | 枯草芽孢杆菌Nudix水解酶/磷酸酶，对IPP和DMAPP同等亲和 |
| Escherichia coli | 异戊二烯合成 | ispS（植物来源） | IspS | 催化 | 异戊二烯合酶，来自白杨(P. alba)、灰杨(P. canescens)、野葛(P. montana)、桉树(E. globulus)等；桉树IspS产量为白杨的5倍 |
| Escherichia coli | 前体支持/糖酵解 | pgl | Pgl | 催化 | 6-磷酸葡糖酸内酯酶，增强PPP通量，提供乙酰-CoA，抑制异源酶糖基化 |
| Escherichia coli | 前体支持/磷酸酮醇酶途径 | pkl | Phosphoketolase | 催化 | 磷酸酮醇酶，将磷酸戊糖/己糖转化为乙酰-CoA，减少碳损失 |
| Escherichia coli | MEP途径调控 | iscR | IscR | 调控 | 铁硫簇基因转录抑制因子，敲除后提高IspG/IspH活性，增加异戊二烯产量 |
| Escherichia coli | MEP途径电子供给 | fldA | Flavodoxin | 能量供给 | 黄素氧还蛋白，为IspG/IspH提供还原力，过表达可促进MEP途径通量 |
| Escherichia coli | MEP途径电子供给 | petF/petH（来自Thermosynechococcus elongatus） | PetF/PetH | 能量供给 | 铁氧还蛋白/铁氧还蛋白-NADP+还原酶，增强IspG/IspH活性 |
关键发现
- 异戊二烯在大肠杆菌中的最高产量达到1832 mg/L（敲除副产物途径后）
- 利用枯草芽孢杆菌DXS和DXR可达到314 mg/L，为天然酶过表达菌株的2倍
- MEP和MVA途径协同使产量分别比单独MEP或MVA提高约20倍和3倍
- 5-L规模发酵异戊烯醇产量为61.9 mg/L
- 白杨IspS的Km为8.7-15.9 mM，kcat为0.03-0.034 s^-1，而桉树IspS的Km为0.2 mM，kcat为0.195 s^-1，产量为白杨的5倍
- IspS定点突变L494使酶活提高约2倍，K272R提高1.8-2倍，定向进化获得3倍产量提升
- HMGS A110G突变使酶促反应提高140倍，异戊二烯产量提高2.3倍
- 引入M. mazei的MK使异戊二烯积累增加5倍
- IDI过表达使β-胡萝卜素产量增加1.4倍
- DXS/DXR/IDI协同进化使异戊二烯产量提高60%
研究结论
大肠杆菌凭借遗传操作成熟、异源表达技术完善等优势，仍是生产异戊二烯和异戊烯醇的主要底盘。通过IspS筛选与进化、MEP/MVA途径改造及前体优化，异戊二烯产量已显著提高，但仍有提升空间；异戊烯醇生产受磷酸酶活性限制，未来需筛选更强酶或构建截短MVA途径。此外，探索新型代谢途径和其他宿主具有潜力。