Biosynthesis and production of sabinene: current state and perspectives
- 作者
- Yujin Cao, Haibo Zhang, Hui Liu, Wei Liu, Rubing Zhang, Mo Xian, Huizhou Liu
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-017-8695-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
桧烯（sabinene）是一种重要的双环单萜，可作为香料、精细化学品和先进生物燃料，但目前缺乏经济可行的商业化生产方法。化学合成因复杂环结构困难，植物提取含量低且分离复杂，需开发微生物合成路线。
研究策略
系统综述了桧烯生物合成途径（MVA和MEP途径）、关键酶桧烯合酶（SabS）的克隆与特性，以及利用大肠杆菌、酿酒酵母、天然产生菌和细胞游离系统等多种宿主和策略实现桧烯生产的研究进展。
核心内容
该研究系统综述了桧烯微生物合成的最新进展。桧烯作为双环单萜，在香料和生物燃料领域具有应用潜力，但化学合成与植物提取均难以满足规模化需求。作者梳理了MVA与MEP两条天然前体供给途径的化学计量差异，并首次汇总了9种已功能鉴定的桧烯合酶，其氨基酸序列一致性为55.37%，均包含DDXXD和RR(X)8W特征基序。通过对不同宿主策略的比较发现，大肠杆菌在同时引入MEP/MVA双途径并共表达GPP合酶与桧烯合酶时，摇瓶产量可达82.18 mg/L，经补料分批发酵提升至2.65 g/L；酿酒酵母通过将Erg20p定向改造为GPP合酶并引入桧烯合酶，产量从0.5 mg/L跃升至17.5 mg/L，提升340倍；而由27种酶组成的无细胞体系实现了15.9 g/L的桧烯产量，达到理论产率的94.5%。这些结果表明，微生物合成路线在技术上完全可行，但当前产量尚不足以支撑工业应用，未来需结合发酵工程与酶工程进一步优化。
创新点
首次全面总结了已功能鉴定的9种桧烯合酶及其序列特征（一致性55.37%，含DDXXD和RR(X)8W基序）；比较了MEP与MVA途径的化学计量差异；列举了从野生菌诱变到代谢工程及无细胞多酶系统生产桧烯的多种策略。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP/MVA途径 | dxs, ipi, ispA（突变体）, 单萜环化酶 | DXS, IPI（来自Haematococcus pluvialis）, FPP合酶突变体, 环化酶（来自Picea abies） | 催化 | 早期工程菌，因环化酶活性差，桧烯仅占主导产物的5.9% |
| Escherichia coli | MVA和MEP途径 | mvaE, mvaS, GPPS, SabS | MvaE, MvaS, GPP合酶, 桧烯合酶（来自S. pomifera） | 催化 | 摇瓶产量82.18 mg/L，补料分批发酵2.65 g/L |
| Escherichia coli | MVA下游途径 | SabS | 桧烯合酶 | 催化 | 以MVA为底物摇瓶产量150 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | ERG20（突变体）, SabS | Erg20p（K197G或F96W-N127W）, 桧烯合酶（来自S. pomifera） | 催化 | 改造Erg20p为GPP合酶后，产量17.5 mg/L，较初始提高340倍 |
| Phomopsis sp. EC-4 | 萜烯生物合成途径 | — | — | 催化 | 野生型内生真菌，桧烯为VOCs主要组分，总VOC产量18.4 ppmv |
| Hypoxylon sp. CI-4 | 萜烯生物合成途径 | — | — | 催化 | 经化学诱变（suberoylanilide hydroxamic acid和5-azacytidine）后产生桧烯、α-侧柏烯等多种萜烯 |
| 无细胞系统 | 糖酵解及MVA/MEP模块 | — | 27种酶 | 催化 | 桧烯产量15.9 g/L，达理论产率94.5% |
| 植物来源（S. officinalis、S. pomifera等） | 桧烯生物合成 | SabS | 桧烯合酶（SabS） | 催化 | 已克隆表征9种植物桧烯合酶，氨基酸序列一致性55.37%，含DDXXD和RR(X)8W保守基序 |
关键发现
- 大肠杆菌经MEP和MVA双途径结合GPP合酶与S. pomifera桧烯合酶，摇瓶产量82.18 mg/L，补料分批发酵达2.65 g/L（甘油得率3.49%）
- 以MVA为底物摇瓶产量150 mg/L
- 酿酒酵母通过将Erg20p改造为GPP合酶并表达桧烯合酶，产量达17.5 mg/L，较初始0.5 mg/L提高340倍
- 无细胞系统（27酶）桧烯产量15.9 g/L，达理论产率的94.5%
- 野生菌Phomopsis sp. EC-4的VOCs总产量仅18.4 ppmv，桧烯为主要组分。
研究结论
微生物合成桧烯是可行的替代路线，目前产量虽低，但通过发酵工程、酶工程和细胞工程等策略有望实现工业化生产。结合传统分子生物学与基因组/蛋白质组学工具将进一步提升桧烯生物合成能力。