A novel DMAPP-responding genetic circuit sensor for high-throughput screening and evolving isoprene synthase
- 作者
- Chun-Li Liu, Jing-Yi Cai, Hao-Ran Bi, Tian-Wei Tan
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-017-8676-8
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
异戊二烯合酶（IspS）天然活性低，缺乏高通量筛选高活性IspS突变体的简单快速方法，限制了异戊二烯生物合成的工业化应用。
研究策略
基于L-阿拉伯糖操纵子，将AraC的L-阿拉伯糖结合域（LBD）替换为IspS，构建IspS-AraC融合蛋白，并以eGFP作为pBAD启动子的报告基因，形成响应DMAPP的遗传电路传感器；通过流式细胞术（FACS）和微孔板检测荧光，结合错误倾向PCR构建IspS突变体库进行筛选。
核心内容
针对异戊二烯合酶（IspS）天然活性低、缺乏高通量筛选方法的问题，该研究构建了一种响应代谢中间体DMAPP的遗传电路传感器。作者将AraC的L-阿拉伯糖结合域替换为IspS，形成IspS-AraC融合蛋白，以eGFP作为pBAD启动子的报告基因，实现酶活性与荧光信号的耦联。流式细胞术分析显示，添加10 μM DMAPP后高荧光阳性细胞比例从34.9%降至21.7%，说明DMAPP在此传感器中充当阻遏物而非诱导物，与天然L-阿拉伯糖机制相反。微孔板检测中，过表达ispS的菌株eGFP荧光提高5倍，同时添加IPTG和L-阿拉伯糖时提高7倍。利用该传感器结合错误倾向PCR构建的突变体库，筛选到两个低活性IspS突变体，其中IS-IC-31（345-349残基截短）荧光降低52.7%、异戊二烯产量降低93%，验证了荧光信号与IspS活性的正相关性。该研究首次实现了DMAPP响应遗传电路传感器，为IspS酶工程提供了一种简便、低成本的高通量筛选工具，也可推广至其他异戊二烯类产物的酶定向进化。
创新点
首次构建响应DMAPP的遗传电路传感器；发现DMAPP在该传感器中作为阻遏物而非诱导物，与天然L-阿拉伯糖诱导机制相反；将该传感器成功应用于IspS突变体库的高通量筛选，实现酶活与荧光信号的耦联。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP/MVA途径 | ispS | IspS | 催化 | 催化DMAPP转化为异戊二烯，是筛选的靶标酶，来源于Populus alba |
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-阿拉伯糖操纵子 | araC | AraC | 调控 | 其LBD被替换为IspS，改造为IspS-AraC融合蛋白，响应DMAPP并调控pBAD启动子 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-阿拉伯糖操纵子 | ispS-araC | IspS-AraC融合蛋白 | 调控 | DMAPP结合时形成二聚体抑制pBAD转录，DMAPP解离时以单体激活pBAD转录 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | pBAD启动子 | eGFP | eGFP | 调控 | 作为报告基因，其表达水平反映pBAD启动子活性，从而指示胞内DMAPP浓度和IspS活性 |
关键发现
- FACS分析显示，添加10 μM DMAPP后，高荧光阳性细胞比例从34.9%降至21.7%（降低38%），最高eGFP荧光强度从10^5降至10^4
- 在微孔板检测中，过表达ispS（IPTG诱导）的菌株IS-IC eGFP荧光提高5倍，同时添加IPTG和L-阿拉伯糖时提高7倍
- 利用该传感器筛选到两个IspS突变体：IS-IC-31（345-349残基截短）荧光降低52.7%，异戊二烯产量降低93%
- IS-IC-34（V93D R116H L148Q A172T F180S L272R M337T L421Q I478F）荧光降至阴性对照水平，异戊二烯产量几乎为零。
研究结论
成功构建了响应DMAPP的遗传电路传感器，验证了eGFP荧光与胞内DMAPP浓度负相关、与IspS活性正相关，并通过筛选低活性突变体验证了该方法作为IspS酶工程高通量筛选工具的可行性。