Characterization of proteins from the 3N5M family reveals an operationally stable amine transaminase
- 作者
- Manideep Kollipara, Philipp Matzel, Miriam Sowa, Stefan Brott, Uwe Bornscheuer, Matthias Hohne
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2022）
- DOI
- 10.1007/s00253-022-12071-1
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
在3N5M转氨酶亚家族中寻找具有高操作稳定性的胺转氨酶，并探究四聚体组装与酶稳定性之间的关联。
研究策略
基于活性位点指纹的数据库挖掘，选取偏离经典3N5M指纹的推定转氨酶基因，在E. coli中重组表达、纯化，系统表征底物谱、储存稳定性、操作稳定性和有机溶剂耐受性。
研究路线图
核心内容
本研究基于活性位点指纹的数据库挖掘策略，从3N5M转氨酶亚家族中筛选并异源表达了多个偏离经典指纹的推定胺转氨酶，系统表征了其底物谱、热稳定性、储存稳定性及有机溶剂耐受性。结果显示，来源于Burkholderia multivorans的TA-10表现突出，对1-苯乙胺与丙酮酸的转氨活性达6 U/mg，熔解温度在储存条件下高达87–88°C，70°C孵育后仍保留75%活性，且在30°C含50%异丙醇或DMSO的体系中孵育16小时无活性损失，60°C操作20小时仅损失15%活性。同时，来自Burkholderia cepacia的TA-9在40°C完全稳定，但50°C操作8小时损失约50%活性。实验还发现，二聚体TA-3HMU同样具备优异操作稳定性，而四聚体TA-3FCR在操作条件下几乎完全失活，表明四聚体组装并非高操作稳定性的充分条件。该研究鉴定出TA-10作为具有高操作稳定性和有机溶剂耐受性的优良生物催化起点，同时证实序列指纹分析仍是预测转氨酶底物谱与发现稳定酶的有效工具。
创新点
发现了来自Burkholderia multivorans的TA-10，具有高催化活性（6 U/mg）、高热稳定性（70°C）和优异的操作稳定性（50%异丙醇/DMSO下16h无失活）；实验证明四聚体结构并不必然带来高操作稳定性，打破了先前关于寡聚态与稳定性关联的假设。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 转氨基（胺转氨酶） | MT828894 | TA-1 (Q9APM5, Bilophila wadsworthia) | 催化 | 牛磺酸:丙酮酸转氨酶，偏好牛磺酸和β-丙氨酸，对(S)-1-苯乙胺活性较低，操作稳定性差。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 转氨基（胺转氨酶） | MT828898 | TA-5 (E1V8W4, Halomonas elongata) | 催化 | 以L-谷氨酸为最佳氨基供体（约70 mU/mg），但整体活性低，真正天然底物尚未确定。 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（共表达groES-groEL伴侣蛋白） | 转氨基（胺转氨酶） | MT828902 | TA-9 (B4EHM2, Burkholderia cepacia) | 催化 | 对环己酮和环辛酮具有较高活性，因含R16而对ω-氨基酸活性增强，操作稳定性中等，50°C下8h损失一半活性。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 转氨基（胺转氨酶） | MT828903 | TA-10 (B9AZ94, Burkholderia multivorans) | 催化 | 高活性高稳定性，对(S)-1-苯乙胺活性6 U/mg，接受异丙胺作氨基供体，耐50%异丙醇/DMSO，70°C下仍保持较高活性。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | β-丙氨酸:丙酮酸转氨酶 | KT861634 | TA-3N5M (Q81SL2, Bacillus anthracis) | 催化 | 已知四聚体参照酶，储存时活性提高3倍，但低PLP下操作稳定性差。 |
| — | 转氨基（胺转氨酶） | — | TA-3HMU (Q5LMU1, Silicibacter pomeroyi) | 催化 | 二聚体参照酶，储存和操作条件下均稳定至50°C，表现优异。 |
| — | 转氨基（胺转氨酶） | — | TA-3FCR (Q1GD43, Silicibacter sp. TM1040) | 催化 | 二聚体参照酶，操作条件下几乎完全失活。 |
关键发现
- TA-10对1-苯乙胺与丙酮酸的转氨活性达6 U/mg，熔解温度在储存条件下高达87-88°C，操作条件下为77.9-81.8°C
- 在70°C下孵育后仍保留75%（储存）和50%（操作）初始活性
- 在30°C下含50%(v/v)异丙醇或DMSO的体系中孵育16h无活性损失，60°C操作20h仅损失15%活性。TA-9在40°C完全稳定，50°C操作8h损失约50%活性
- TA-1和TA-3N5M在低PLP浓度下操作稳定性差
- 二聚体TA-3HMU也表现出优异操作稳定性，而TA-3FCR在操作条件下几乎完全失活。
研究结论
从3N5M亚家族中鉴定了两个热稳定四聚体转氨酶，其中TA-10因高操作稳定性和有机溶剂耐受性成为有前景的生物催化起点；然而四聚体结构并非高操作稳定性的充分条件，序列指纹分析仍是预测底物谱和发现稳定酶的有效工具。