Divergent roles of the acetyl-CoA synthetases RkACS1 and RkACS2 in carotenoid and lipid biosynthesis in Rhodosporidium kratochvilovae
- 作者
- Meixia He, Xiaoxia Yang, Chao Xiong, Yuxuan Gan, Hongjun Ma, Jingwen Qiu, Yuan Chen, Qi Zhang
- 单位
- Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2025）
- DOI
- 10.1007/s00253-025-13534-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明红酵母Rhodosporidium kratochvilovae中乙酰-CoA合成酶同工酶RkACS1和RkACS2在类胡萝卜素和脂质生物合成中的不同生理功能及调控机制，为优化乙酰-CoA衍生物的生产提供靶点。
研究策略
利用CRISPR-Cas9基因敲除和回补策略，构建RkACS1和RkACS2敲除菌株及回补菌株，比较不同碳源上的生长表型，测定细胞内乙酸、乙酰-CoA、总类胡萝卜素、总脂质及脂肪酸组成，通过qPCR分析相关代谢基因表达，并用免疫印迹检测组蛋白H3乙酰化水平。
核心内容
本研究通过CRISPR-Cas9基因敲除和回补策略，系统解析了红酵母Rhodosporidium kratochvilovae中乙酰-CoA合成酶同工酶RkACS1和RkACS2的差异化功能。结果显示，敲除RkACS1使乙酸积累增加34.65%、乙酰-CoA水平降低34.62%，类胡萝卜素含量下降20.22%，而总脂和总脂肪酸分别增加140.68%和114.13%；敲除RkACS2则导致乙酰-CoA降低25.37%、总脂和总脂肪酸分别减少16.83%和13.58%，但类胡萝卜素无显著变化。回补实验表明，回补RkACS1或RkACS2后类胡萝卜素分别恢复至7.28和6.25 mg/g DCW，较野生型提高63.59%和40.45%。机制研究发现RkACS1在葡萄糖饥饿时表达上调7.51倍，且RkACS1敲除株中RkACS2在饥饿条件下表达上调9.89倍，提示两基因间存在相互调控；RkACS2缺失使组蛋白H3K9乙酰化水平降低41.19%，表明其通过影响核内表观遗传修饰调控基因表达。该研究首次揭示了RkACS1与类胡萝卜素合成直接相关，而RkACS2主要参与脂质合成和核内乙酰化调控，二者功能冗余且相互补偿，为理性改造乙酰-CoA代谢流以优化类胡萝卜素等次级代谢产物生产提供了重要靶点。
创新点
首次揭示RkACS1与类胡萝卜素生物合成直接相关；发现RkACS1和RkACS2之间存在功能冗余和相互调控；证实RkACS2通过影响核内组蛋白乙酰化调控基因表达；阐明二者在碳源利用、类胡萝卜素和脂质代谢中的差异化分工。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 乙酰-CoA代谢（乙酸利用） | RkACS1 | 乙酰-CoA合成酶1 | 催化 | 对非发酵碳源（乙酸、乙醇、甘油）利用必需；受葡萄糖抑制；参与类胡萝卜素合成 |
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 乙酰-CoA代谢（脂肪酸/脂质合成） | RkACS2 | 乙酰-CoA合成酶2 | 催化 | 主要参与脂肪酸和脂质合成；影响核内组蛋白乙酰化；表达不受葡萄糖调控 |
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 甲羟戊酸（MVA）通路 | RkHMGCR | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 类胡萝卜素合成上游基因，RkACS1敲除后表达受抑，回补后恢复 |
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 异戊二烯/类胡萝卜素合成 | RkIPI | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | RkACS1敲除后表达下调，回补后上调 |
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 类胡萝卜素合成 | RkCrtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | RkACS2敲除中表达受抑 |
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 类胡萝卜素合成 | RkCrtYB | 八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶 | 催化 | RkACS1敲除中表达显著受抑 |
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 脂肪酸合成 | RkFAS1 | 脂肪酸合酶 | 催化 | RkACS1敲除中上调，RkACS2敲除中下调 |
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 脂肪酸合成 | RkACCS | 乙酰-CoA羧化酶 | 催化 | 表达变化与RkFAS1一致 |
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 脂肪酸β-氧化 | RkACOX2 | 脂酰-CoA氧化酶 | 催化 | RkACS1敲除中下调，RkACS2敲除中上调 |
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 脂肪酸β-氧化 | RkACAA1 | 3-氧酰基-CoA硫解酶 | 催化 | RkACS2敲除中上调 |
| Rhodosporidium kratochvilovae YM25235 | 表观遗传调控 | — | 组蛋白H3 | 调控 | RkACS2影响其第9位赖氨酸乙酰化水平，进而调节基因表达 |
关键发现
- RkACS1缺失使乙酸积累增加34.65%（38.70→52.11 mg/L），乙酰-CoA水平降低34.62%（698.34→456.55 nmol/mg），类胡萝卜素含量降低20.22%（4.45→3.55 mg/g DCW），但总脂增加140.68%（6.12→14.73% DCW）、总脂肪酸增加114.13%（32.63→69.87 mg/g）
- RkACS2缺失使乙酸增加21.78%，乙酰-CoA降低25.37%（→521.13 nmol/mg），类胡萝卜素无显著变化，总脂降低16.83%（→5.09% DCW）、总脂肪酸降低13.58%（→28.20 mg/g）。回补RkACS1或RkACS2后类胡萝卜素分别达7.28和6.25 mg/g DCW（较野生型高63.59%和40.45%），总脂肪酸分别回升至45.60和48.02 mg/g。RkACS1在葡萄糖饥饿时表达上调7.51倍，RkACS1敲除株中RkACS2在葡萄糖饥饿下表达上调9.89倍
- RkACS2缺失使组蛋白H3K9乙酰化水平降低41.19%。
研究结论
RkACS1和RkACS2在Rhodosporidium kratochvilovae YM25235中具有分化功能：RkACS1对非发酵碳源利用和类胡萝卜素合成至关重要，而RkACS2主要参与脂肪酸/脂质合成及核内组蛋白乙酰化调控；两者存在功能冗余和相互调控，为靶向改造乙酰-CoA代谢提高次级代谢产物产量提供了依据。