Novel 9-cis/all-trans β-carotene isomerases from plasticid oils bodies in Dunaliella bardawil catalyze the conversion of all-trans to 9-cis β-carotene
- 作者
- Lital Davidi, Uri Pick
- 杂志
- Plant Cell Reports（2017）
- DOI
- 10.1007/s00299-017-2110-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示耐盐藻Dunaliella bardawil在光胁迫下积累9-顺式β-胡萝卜素的分子机制，鉴定催化全反式β-胡萝卜素转化为9-顺式β-胡萝卜素的新型异构酶。
研究策略
基于Dunaliella bardawil质体脂滴的蛋白质组分析，鉴定到与水稻D27同源的候选异构酶；通过基因表达分析、体外酶活测定及在大肠杆菌中的异源共表达，验证其催化功能。
核心内容
耐盐绿藻杜氏盐藻在光胁迫下可积累占干重高达10%的β-胡萝卜素，其中约一半为9-顺式异构体。本研究通过对该藻质体脂滴的蛋白质组学分析，鉴定到两个与水稻D27同源的候选蛋白9-cis-βC-ISO1和9-cis-βC-ISO2，它们在油滴中的富集程度比一般叶绿体蛋白高6至17倍。体外酶活测定显示，9-cis-βC-ISO2可将28%的全反式β-胡萝卜素转化为9-顺式形式，9-cis-βC-ISO1活性较低但依然显著。进一步在大肠杆菌中异源共表达验证了功能，48小时时9-cis-βC-ISO2的转化效率高于水稻D27。两个异构酶基因的mRNA在氮缺乏或高光胁迫下表达增强，并在12小时和96小时出现双峰。上述结果首次从酶学层面阐明了杜氏盐藻中9-顺式β-胡萝卜素形成的分子机制，为利用微生物或藻类异源生产高价值9-顺式β-胡萝卜素提供了新的基因元件和应用基础。
创新点
首次从Dunaliella bardawil中鉴定并功能验证了9-顺式/全反式β-胡萝卜素异构酶9-cis-βC-ISO1和9-cis-βC-ISO2；证明这些酶定位于质体脂滴并受光胁迫诱导，阐明了9-顺式β-胡萝卜素形成的酶学基础。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Dunaliella bardawil | β-胡萝卜素生物合成 | 9-cis-βC-iso1 | 9-cis-βC-ISO1 | 催化 | 质体脂滴蛋白，受光胁迫诱导，体外催化全反式β-胡萝卜素转化为9-顺式β-胡萝卜素 |
| Dunaliella bardawil | β-胡萝卜素生物合成 | 9-cis-βC-iso2 | 9-cis-βC-ISO2 | 催化 | 主要异构酶，体外实验转化28%全反式β-胡萝卜素，体内表达活性高于水稻D27 |
| Escherichia coli | β-胡萝卜素生物合成（异源） | 9-cis-βC-iso1 | 9-cis-βC-ISO1 | 催化 | 与β-胡萝卜素合成基因共表达，体内验证异构化活性 |
| Escherichia coli | β-胡萝卜素生物合成（异源） | 9-cis-βC-iso2 | 9-cis-βC-ISO2 | 催化 | 与β-胡萝卜素合成基因共表达，48h时异构化效果优于水稻D27 |
| Escherichia coli | β-胡萝卜素生物合成（异源） | OsD27 | D27 | 催化 | 水稻D27作为阳性对照 |
| Oryza sativa | 独脚金内酯生物合成 | OsD27 | D27 | 催化 | 参考序列，已知9-顺式/全反式β-胡萝卜素异构酶 |
关键发现
- 从Dunaliella bardawil质体脂滴中鉴定到两个与水稻D27高度同源的蛋白9-cis-βC-ISO1和9-cis-βC-ISO2，与叶绿体蛋白相比，在油滴中富集6-17倍
- 体外实验中9-cis-βC-ISO2催化28%的全反式β-胡萝卜素转化为9-顺式β-胡萝卜素，9-cis-βC-ISO1活性较低但显著
- 在大肠杆菌中异源表达9-cis-βC-iso1或9-cis-βC-iso2基因可增强全反式向9-顺式β-胡萝卜素的转化，48h时9-cis-βC-iso2的转化效率高于水稻D27
- 两个异构酶基因mRNA在光胁迫（N缺乏/高光）下表达增强，时间曲线在12h和96h出现两个峰值
- Dunaliella bardawil可积累高达干重10%的β-胡萝卜素，其中9-顺式和全反式约1:1。
研究结论
9-cis-βC-ISO1和9-cis-βC-ISO2是Dunaliella bardawil中催化全反式β-胡萝卜素向9-顺式β-胡萝卜素转化的异构酶，它们在光胁迫下与β-胡萝卜素生物合成酶协同表达，负责9-顺式β-胡萝卜素的形成。这一发现为理解微藻中9-顺式β-胡萝卜素的生物合成提供了酶学证据，并具有潜在的应用价值。