Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana
- 作者
- James Reed, Anne Osbourn
- 杂志
- Plant Cell Reports（2018）
- DOI
- 10.1007/s00299-018-2296-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用本氏烟草瞬时表达系统高效生产萜类化合物，克服天然产物来源有限和化学合成困难的问题。
研究策略
综述了通过农杆菌介导的瞬时表达在本氏烟草中重构萜类生物合成途径的策略，包括增强前体供应（表达tHMGR、DXS、GPPS等）、区室化靶向、沉默竞争途径、组合生物合成以及利用基因簇挖掘等。
研究路线图
核心内容
本研究系统综述了利用农杆菌介导的瞬时表达在本氏烟草中生产萜类化合物的策略与进展。核心思路包括：通过共表达tHMGR、DXS、FPS、GPPS、GGPPS等前体供应增强基因以提升通量；通过线粒体、质体等亚细胞区室靶向优化产物积累；通过沉默SQS、EAS、PSY等竞争途径酶减少碳流分流；并通过组合不同来源的环化酶与P450氧化酶实现新结构萜类的生物合成。关键结果方面，倍半萜内酯costunolide经线粒体靶向产量达60 ng/g FW，较胞质提高15倍；青蒿素前体artemisinic acid产量达16.6 mg/kg FW，融合构建与线粒体靶向使amorpha-4,11-diene在叶片内积累提高约7倍；单萜香叶醇经质体靶向GES与GPPS共表达产量最高达129 μg/g FW，较单独表达GES提高2至3倍。此外，组合11个class II与9个class I二萜环化酶获得51个功能配对，产生多种to-nature新产物。这些结果表明，瞬时表达平台通过快速组合途径基因与亚细胞工程，可在数天内实现从微克到毫克甚至克级的萜类产量，并拓展化合物结构多样性，为植物底盘代谢工程提供了灵活高效的工具。
创新点
总结了多种提高产量的策略，特别是利用瞬时表达快速组合不同基因产生新结构萜类，以及通过区室化靶向和基因簇挖掘实现新天然产物的生成。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | MVA通路 | HMGR | 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 截短形式tHMGR可提高倍半萜和三萜产量 |
| Nicotiana benthamiana | MVA通路 | FPS | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 提供FPP前体，与tHMGR共表达提高(+)-valencene产量 |
| Nicotiana benthamiana | MVA通路/三萜合成 | SQS | squalene synthase | 催化 | 与目标途径竞争FPP，沉默可提高(+)-valencene，过表达可提高β-amyrin |
| Nicotiana benthamiana | MEP通路 | DXS | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase | 催化 | MEP途径限速酶，过表达提高二萜产量 |
| Nicotiana benthamiana | MEP通路/单萜合成 | GPPS | geranyl diphosphate synthase | 催化 | 提供GPP前体，小亚基共表达提高单萜产量 |
| Nicotiana benthamiana | MEP通路/二萜合成 | GGPPS | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 提供GGPP前体，与DXS共表达提高二萜产量 |
| Nicotiana benthamiana | 单萜合成 | GES | geraniol synthase | 催化 | 催化GPP生成geraniol，靶向质体可提高产量 |
| Nicotiana benthamiana | 倍半萜合成/青蒿素前体 | ADS | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化FPP生成amorpha-4,11-diene，线粒体靶向提高产量 |
| Nicotiana benthamiana | 倍半萜合成 | EAS | 5-epi-aristolochene synthase | 催化 | 内源竞争酶，沉默提高(+)-valencene产量 |
| Nicotiana benthamiana | 类胡萝卜素合成/二萜合成 | PSY | phytoene synthase | 催化 | 与taxadiene synthase竞争GGPP，沉默提高taxadiene产量1.9倍 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素合成 | LTP3 | lipid transfer protein 3 | 转运 | 转运青蒿素前体至质外体，减少糖基化损失 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素合成 | PD2 | pleiotropic drug resistance transporter 2 | 转运 | 转运青蒿素前体，与LTP3共表达提高artemisinin产量约50% |
| Nicotiana benthamiana | 三萜合成 | P450 | cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 催化β-amyrin氧化，多种P450组合产生新衍生物 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜合成 | cyclases | class II and class I diterpene cyclases | 催化 | 11个class II和9个class I环化酶组合产生51个功能配对和新骨架 |
| Nicotiana benthamiana | sesterterpene合成 | GFPS | geranylfarnesyl diphosphate synthase | 催化 | 提供C25前体GFPP，用于sesterterpene产生 |
| Nicotiana benthamiana | sesterterpene合成 | sesterterpene synthase | sesterterpene synthase | 催化 | 催化GFPP环化生成sesterterpene |
| Nicotiana benthamiana | 囊泡运输 | VAMP72 | vesicle-associated membrane protein 72 | 转运 | RNAi沉默VAMP72基因使萜烯释放提高5倍 |
关键发现
- 在本氏烟草中瞬时表达成功生产多种萜类：costunolide通过线粒体靶向产量达60 ng/g FW，比胞质提高15倍
- parthenolide产量1.4 μg/g FW，表达HMGR使前体costunolide提高4倍
- (+)-valencene产量0.70 μg/g FW/24h，表达tHMGR和FPS提高2.9倍，沉默SQS和EAS可再提高2.8倍
- artemisinic acid产量16.6 mg/kg FW，融合构建和线粒体靶向使amorpha-4,11-diene在顶空提高约2倍、叶片内提高约7倍
- artemisinin产量3 ng/mg DW，表达LTP3和PD2加HMGR在13天后提高约50%
- 三萜β-amyrin衍生物产量0.12-3.3 mg/g DW，表达tHMGR提高4倍
- 单萜产量5.55-19.08 μg/g FW/24h，表达GPPS小亚基使(-)-linalool提高4-5倍
- geraniol产量最高129 μg/g FW，质体靶向GES和GPPS比单GES提高2-3倍
- taxadiene产量48 μg/g DW，沉默PSY提高1.9倍
- isopimaric acid产量45-55 μg/g DW，表达DXS和GGPPS提高3倍
- diterpene产量0.5-5 mg，组合DXS和GGPPS提高约10倍
- cembratrienol产量2500 ng/cm²，DXS+GGPPS2提高3.5倍
- sesterterpene产量0.02-1.13 mg/g DW。组合11个class II和9个class I二萜环化酶得到51个功能配对，产生新to-nature产物
- 多种β-amyrin氧化P450组合产生新衍生物并可纯化至克级。
研究结论
瞬时表达在本氏烟草中生产萜类化合物是一种快速、可扩展且灵活的平台，通过优化前体供应、区室化靶向和组合生物合成，可获得毫克至克级的产量，并产生新的分子多样性。该平台有望成为代谢工程领域的一项颠覆性技术。