Cloning and selection of carotenoid ketolase genes for the engineering of high-yield astaxanthin in plants
- 作者
- Junchao Huang, Yujuan Zhong, Gerhard Sandmann, Jin Liu, Feng Chen
- 单位
- 中国科学院昆明植物研究所；香港大学生物科学学院；约翰·沃尔夫冈·歌德大学分子生物科学系（生物合成组）；北京大学生物与生物资源工程研究所（工学院）
- 杂志
- Planta（2012）
- DOI
- 10.1007/s00425-012-1654-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物中虾青素产量低，缺乏高效催化玉米黄素向虾青素转化的β-胡萝卜素酮醇酶（BKT）基因。
研究策略
从五种绿藻中克隆bkt cDNA，在大肠杆菌中表征其功能，筛选出能高效转化玉米黄素为虾青素的C. reinhardtii BKT，并通过农杆菌介导的核转化在烟草中表达该基因（融合RBCS转运肽靶向叶绿体）以评价其工程效果。
核心内容
本研究从五种绿藻中克隆了β-胡萝卜素酮醇酶（BKT）基因，并在大肠杆菌中表征其功能，旨在筛选能高效催化玉米黄素转化为虾青素的酶。结果显示，莱茵衣藻BKT的玉米黄素酮化活性最高，转化率约85%，显著优于其他来源。将该基因与RBCS转运肽融合后通过农杆菌介导核转化导入烟草，转基因株系N20和N28叶片总类胡萝卜素含量分别达4.11和4.24 mg/g干重，约为野生型（2.06 mg/g干重）的两倍，其中虾青素含量达1.49至1.60 mg/g干重，酮类胡萝卜素占总类胡萝卜素约87%，并伴随叶片变棕和花色改变。该工作证明了核基因组表达莱茵衣藻BKT可高效驱动虾青素在高等植物中的积累，效果与叶绿体转化相当，为植物作为虾青素生产平台提供了高效基因资源和可行策略。
创新点
发现莱茵衣藻BKT具有最高的玉米黄素酮化活性（约85%转化率）；首次在高等植物中表达该BKT，使叶片总类胡萝卜素含量翻倍并积累以虾青素为主的酮类胡萝卜素，达到与叶绿体转化相当的水平。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | β-胡萝卜素→角黄素→虾青素（类胡萝卜素生物合成） | Chlblkt（Chlorococcum sp. bkt） | β-胡萝卜素酮醇酶（BKT） | 催化 | 在β-胡萝卜素积累的大肠杆菌中可将β-胡萝卜素转化为角黄素，在玉米黄素积累的菌株中可部分将玉米黄素转化为虾青素 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | Crblkt（Chlamydomonas reinhardtii bkt） | β-胡萝卜素酮醇酶（BKT） | 催化 | 在玉米黄素积累的大肠杆菌中，将玉米黄素转化为虾青素的转化率约85%，为所测试BKT中最高 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | Nbkt（Neochloris wimmeri bkt） | β-胡萝卜素酮醇酶（BKT） | 催化 | 对β-胡萝卜素有高效酮化活性，但将玉米黄素转化为虾青素的活性极低 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | Pbkt（Protosiphon botryoides bkt） | β-胡萝卜素酮醇酶（BKT） | 催化 | 能将β-胡萝卜素转化为角黄素，也能将玉米黄素转化为虾青素但活性较低 |
| Escherichia coli JM109 | 类胡萝卜素生物合成 | Sblkt（Scotiellopsis oocystiformis bkt） | β-胡萝卜素酮醇酶（BKT） | 催化 | 在β-胡萝卜素积累的大肠杆菌中未能高效催化生成角黄素（HPLC分析显示活性受限），对玉米黄素酮化活性也较低 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Xanthi） | 类胡萝卜素生物合成 | Crbkt（莱茵衣藻bkt，与RBCS转运肽融合） | β-胡萝卜素酮醇酶（BKT） | 催化 | 转基因株系N20/N28叶片总类胡萝卜素含量达4.11-4.24 mg/g DW（约2倍于野生型），虾青素最高1.60 mg/g DW，酮类胡萝卜素占总类胡萝卜素87% |
| 烟草叶绿体（靶向部位） | 类胡萝卜素生物合成（叶绿体） | RBCS转运肽序列 | 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基转运肽 | 区室化 | 用于引导BKT定位于叶绿体，使酶与类胡萝卜素合成途径共区室化 |
关键发现
- 从五种绿藻中克隆并表征了5个bkt cDNA，其编码的BKT均能高效地将β-胡萝卜素转化为角黄素（除S. oocystiformis外），但在玉米黄素转化为虾青素的活性上差异显著：C. reinhardtii BKT转化率最高（约85%），Chlorococcum BKT次之，P. botryoides和S. oocystiformis较低，N. wimmeri极低。将C. reinhardtii BKT转入烟草后，转基因株系N20和N28叶片总类胡萝卜素含量分别为4.11±0.12和4.24±0.07 mg/g DW，比野生型（2.06±0.10 mg/g DW）提高约2倍
- 虾青素含量分别达1.49±0.08和1.60±0.13 mg/g DW
- 酮类胡萝卜素占总类胡萝卜素的约87%，并表现出棕色叶片和花色改变。
研究结论
本研究筛选出的C. reinhardtii BKT能高效催化玉米黄素向虾青素的转化，在烟草中表达可显著提高类胡萝卜素总量并积累高水平的虾青素，为利用植物细胞工厂生产虾青素提供了有价值的基因资源。