Peroxisomal localisation of the final steps of the mevalonic acid pathway in planta
- 作者
- Andrew J. Simkin, Grégory Guirimand, Nicolas Papon, Vincent Courdavault, Insaf Thabet, Olivia Ginis, Sadok Bouzid, Nathalie Giglioli-Guivarc'h, Marc Clastre
- 单位
- EA 2106, Biomolécules et Biotechnologies Végétales, Université François-Rabelais de Tours; Laboratoire de Biotechnologie et Physiologie Végétale, Département des Sciences Biologiques, Faculté des Sciences de Tunis
- 杂志
- Planta（2011）
- DOI
- 10.1007/s00425-011-1444-6
- 所属领域
- 植物代谢
- 关键词
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解决的核心问题
植物甲羟戊酸（MVA）途径最后三步酶（MVK、PMK、MVD）的亚细胞定位尚不清楚，此前缺乏直接的实验证据。
研究策略
从长春花（Catharanthus roseus）中克隆MVK、PMK和MVD的cDNA，通过酵母功能互补验证其酶活；构建YFP融合蛋白，利用基因枪瞬时转化长春花悬浮细胞，与细胞质或过氧化物酶体标记物共定位，并在拟南芥同源基因中加以验证。
研究路线图
核心内容
该研究以长春花和拟南芥为材料，系统解析了植物甲羟戊酸（MVA）途径最后三步酶——甲羟戊酸激酶（MVK）、5-磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）的亚细胞定位。研究者从长春花中克隆了CrMVK、CrPMK和CrMVD的cDNA，通过酵母功能互补实验证实三种cDNA分别能互补erg12Δ、erg8Δ和mvd1Δ突变株，且突变株在含FOA的培养基上无法生长，证明其具有相应酶活。亚细胞定位结果显示，CrMVK-YFP和YFP-CrMVK均呈弥散细胞质荧光，而CrPMK-YFP和CrMVD-YFP呈点状荧光并与过氧化物酶体标记共定位；YFP-CrPMK和YFP-CrMVD则呈细胞质分布。拟南芥同源基因AtMVK-YFP定位于细胞质，而AtPMK-YFP和AtMVD-YFP定位于过氧化物酶体。该研究首次通过实验证实植物MVA途径中PMK和MVD定位于过氧化物酶体，而MVK定位于细胞质。结合已有的IDI定位研究，提示最后三步酶（PMK、MVD、IDI）均位于过氧化物酶体，表明植物异戊二烯生物合成的经典区室模型需将过氧化物酶体纳入。
创新点
首次通过实验证实植物MVA途径中PMK和MVD定位于过氧化物酶体，而MVK定位于细胞质；提出过氧化物酶体是植物异戊二烯生物合成的额外区室。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus (长春花) | 甲羟戊酸(MVA)途径 | CrMVK | 甲羟戊酸激酶 (MVK) | 催化 | 定位于细胞质；酵母互补验证其功能 |
| Catharanthus roseus (长春花) | 甲羟戊酸(MVA)途径 | CrPMK | 5-磷酸甲羟戊酸激酶 (PMK) | 催化 | 定位于过氧化物酶体；YFP-PMK（N端融合）为细胞质，PMK-YFP（C端融合）为过氧化物酶体 |
| Catharanthus roseus (长春花) | 甲羟戊酸(MVA)途径 | CrMVD | 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 (MVD) | 催化 | 定位于过氧化物酶体；YFP-MVD为细胞质，MVD-YFP为过氧化物酶体 |
| Arabidopsis thaliana (拟南芥) | 甲羟戊酸(MVA)途径 | AtMVK | 甲羟戊酸激酶 (MVK) | 催化 | 定位于细胞质，与CrMVK一致 |
| Arabidopsis thaliana (拟南芥) | 甲羟戊酸(MVA)途径 | AtPMK | 5-磷酸甲羟戊酸激酶 (PMK) | 催化 | 定位于过氧化物酶体，与CrPMK一致 |
| Arabidopsis thaliana (拟南芥) | 甲羟戊酸(MVA)途径 | AtMVD1 | 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 (MVD) | 催化 | 定位于过氧化物酶体，与CrMVD一致 |
| Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母) | 甲羟戊酸(MVA)途径 | ERG12/ERG8/MVD1 | 对应的酿酒酵母MVK/PMK/MVD | 催化 | 用于酵母互补实验的靶基因敲除株，验证长春花同源基因功能 |
关键发现
- CrMVK编码387个氨基酸（41.0 kDa），CrPMK编码498个氨基酸（53.9 kDa），CrMVD编码421个氨基酸（46.6 kDa）。酵母互补实验中，CrMVK、CrPMK、CrMVD分别能互补erg12Δ、erg8Δ、mvd1Δ突变株，且突变株在含FOA的培养基上无法生长，证明三种cDNA具有相应酶活。亚细胞定位显示：CrMVK-YFP和YFP-CrMVK均呈弥散细胞质荧光
- YFP-CrPMK呈细胞质分布，而CrPMK-YFP呈点状荧光并与过氧化物酶体标记共定位
- YFP-CrMVD呈细胞质分布，而CrMVD-YFP和AtMVD-YFP呈点状荧光并与过氧化物酶体标记共定位。同样，AtMVK-YFP为细胞质定位，AtPMK-YFP为过氧化物酶体定位。
研究结论
植物MVA途径中，MVK是细胞质酶，而PMK和MVD定位于过氧化物酶体；结合已有的IDI定位研究，最后三步（PMK、MVD、IDI）位于过氧化物酶体，提示植物异戊二烯生物合成的经典区室模型需将过氧化物酶体纳入。