Isolation and functional characterisation of banana phytoene synthase genes as potential cisgenes
- 作者
- Bulukani Milalazi, Ralf Welsch, Priver Namanya, Harjeet Khanna, R. Jason Geijskes, Mark D. Harrison, Rob Harding, James L. Dale, Marion Bateson
- 单位
- Centre for Tropical Crops and Biocommodities, Queensland University of Technology, Brisbane, Queensland 4001, Australia; Faculty of Biology, University of Freiburg, D79104 Freiburg, Germany
- 杂志
- Planta（2012）
- DOI
- 10.1007/s00425-012-1717-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究香蕉不同品种果实中前维生素A类胡萝卜素(pVAC)含量差异的分子机制，并分离鉴定可作为cisgenic或intragenic改良候选基因的香蕉八氢番茄红素合成酶(PSY)基因。
研究策略
从高pVAC含量的Asupina和低pVAC含量的Cavendish香蕉中分离PSY1和PSY2a基因；进行序列及系统发育分析；比较不同组织中基因表达；在水稻愈伤组织和E. coli中异源表达验证酶功能并比较酶活性。
核心内容
本研究从高前维生素A类胡萝卜素（pVAC）含量的香蕉品种Asupina和低pVAC含量的Cavendish中分离了香蕉八氢番茄红素合成酶（PSY）基因家族成员PSY1与PSY2a，并进行序列、系统发育及组织表达分析。结果显示PSY2a在果实中表达高于叶片，PSY1则相反。通过水稻愈伤组织及大肠杆菌异源表达验证了所有PSY均编码功能性酶，且Asupina来源的PSY1和PSY2a酶活性均约为Cavendish对应酶的2倍。水稻愈伤中表达PSY后类胡萝卜素含量达600–960 μg/g DW。Asupina果实β-胡萝卜素含量为14.5 μg/g FW，而Cavendish仅为0.72 μg/g FW，相差约20倍，但两品种PSY mRNA丰度并无显著差异，提示果实pVAC差异主要源于酶活性而非转录水平。此外，Cavendish PSY2a的3'UTR存在162 bp重复序列，可能影响mRNA稳定性。该研究首次报道香蕉PSY基因家族，证明A-PSY2a是香蕉pVAC生物强化（cisgenic或intragenic改良）的理想候选基因，为利用香蕉自身基因提高果实营养品质奠定了分子基础。
创新点
首次在香蕉中报道PSY基因家族（PSY1和PSY2a）；证明Asupina PSY酶活性约为Cavendish对应酶的2倍；提出利用香蕉自身PSY基因进行cisgenic或intragenic遗传改良以提高果实pVAC含量。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 香蕉（Musa sp. cv. Asupina） | 类胡萝卜素生物合成 | A-PSY1 | 八氢番茄红素合成酶1（Phytoene synthase 1） | 催化 | 从高pVAC品种Asupina中分离，与Cavendish PSY1相比有15个氨基酸差异 |
| 香蕉（Musa sp. cv. Asupina） | 类胡萝卜素生物合成 | A-PSY2a | 八氢番茄红素合成酶2a（Phytoene synthase 2a） | 催化 | 从高pVAC品种Asupina中分离，果实中表达高于叶片 |
| 香蕉（Musa acuminata cv. Cavendish） | 类胡萝卜素生物合成 | Ma-PSY1 | 八氢番茄红素合成酶1（Phytoene synthase 1） | 催化 | 从低pVAC品种Cavendish中分离 |
| 香蕉（Musa acuminata cv. Cavendish） | 类胡萝卜素生物合成 | Ma-PSY2a | 八氢番茄红素合成酶2a（Phytoene synthase 2a） | 催化 | 从低pVAC品种Cavendish分离，其3'UTR含162 bp重复，可能影响mRNA稳定性 |
| 香蕉（Musa sp. cv. Cavendish） | 类胡萝卜素生物合成 | Ma-PSY2b | 八氢番茄红素合成酶2b（Phytoene synthase 2b） | 催化 | 仅在Cavendish中发现的部分序列，共享85%核苷酸同源性，待进一步表征 |
| 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | A-PSY1 | 八氢番茄红素合成酶1 | 催化 | 转基因水稻愈伤中表达，总类胡萝卜素含量600-960 μg/g DW |
| 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | A-PSY2a | 八氢番茄红素合成酶2a | 催化 | 转基因水稻愈伤中表达，Raman光谱证实主要为β-胡萝卜素积累 |
| 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | Ma-PSY1 | 八氢番茄红素合成酶1 | 催化 | 转基因水稻愈伤中表达，功能正常 |
| 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | Ma-PSY2a | 八氢番茄红素合成酶2a | 催化 | 转基因水稻愈伤中表达，功能正常 |
| 水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成 | Zm-PSY1 | 玉米八氢番茄红素合成酶1 | 催化 | 作为阳性对照（Golden Rice 2基因），同条件下表达 |
| 大肠杆菌（E. coli BL21-CodonPlus-RIL） | 类胡萝卜素生物合成（异源重构） | A-PSY1 | 八氢番茄红素合成酶1 | 催化 | 与GGPS和CrtI共表达，比Ma-PSY1酶活性约高2倍 |
| 大肠杆菌（E. coli BL21-CodonPlus-RIL） | 类胡萝卜素生物合成（异源重构） | A-PSY2a | 八氢番茄红素合成酶2a | 催化 | 与GGPS和CrtI共表达，比Ma-PSY2a酶活性约高2倍，且高于A-PSY1和Ma-PSY1 |
| 大肠杆菌（E. coli BL21-CodonPlus-RIL） | 类胡萝卜素生物合成（异源重构） | Ma-PSY1 | 八氢番茄红素合成酶1 | 催化 | 与GGPS和CrtI共表达，酶活性较低 |
| 大肠杆菌（E. coli BL21-CodonPlus-RIL） | 类胡萝卜素生物合成（异源重构） | Ma-PSY2a | 八氢番茄红素合成酶2a | 催化 | 与GGPS和CrtI共表达，酶活性较低 |
| 大肠杆菌（E. coli BL21-CodonPlus-RIL） | 类胡萝卜素生物合成（异源重构） | GGPS | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase） | 催化 | 来自Sinapis alba，与PSY共表达以提供底物GGPP |
| 大肠杆菌（E. coli BL21-CodonPlus-RIL） | 类胡萝卜素生物合成（异源重构） | CrtI | 八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase） | 催化 | 来自Pantoea ananatis，与PSY共表达使产物转化为番茄红素 |
关键发现
- 香蕉具有两个PSY旁系同源基因PSY1和PSY2
- PSY2a在果实中表达高于叶，而PSY1在叶中较高
- 所有香蕉PSY基因均编码有功能的酶
- 水稻愈伤中表达PSY后类胡萝卜素含量达600-960 μg/g DW
- E. coli异源表达显示Asupina PSY1和PSY2a的酶活性比相应Cavendish酶高约2倍（约2-fold），且A-PSY2a活性显著高于A-PSY1和Ma-PSY1
- Asupina果实β-胡萝卜素含量为14.5 μg/g FW，Cavendish为0.72 μg/g FW，相差约20倍
- Cavendish PSY2a的3'UTR存在162 bp重复序列，可能影响mRNA稳定性。
研究结论
Asupina与Cavendish果实pVAC含量差异主要源于PSY酶活性的差异而非mRNA丰度；A-PSY2a是用于香蕉pVAC生物强化（cisgenic/intragenic）的良好候选基因。