Expression and functional analysis of two lycopene β-cyclases from citrus fruits
- 作者
- Lancui Zhang, Gang Ma, Yuki Shirai, Masaya Kato, Kazuki Yamawaki, Yoshinori Ikoma, Hikaru Matsumoto
- 单位
- Department of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Agriculture, Shizuoka University; Fruit Tree Research Center, Shizuoka Prefectural Research Institute of Agriculture and Forestry; Department of Citrus Research, National Institute of Fruit Tree Science
- 杂志
- Planta（2012）
- DOI
- 10.1007/s00425-012-1690-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明柑橘果实中两个番茄红素β-环化酶基因（CitLCYb1和CitLCYb2）的功能及其在类胡萝卜素积累中的不同作用，特别是对α-胡萝卜素形成的贡献
研究策略
从三种柑橘品种（温州蜜柑、瓦伦西亚橙、里斯本柠檬）中分离CitLCYb1和CitLCYb2，进行序列相似性、转运肽和蛋白质二级结构预测；利用番茄红素积累的大肠杆菌进行颜色互补实验及HPLC分析；通过实时定量RT-PCR分析果实成熟过程中基因表达变化
核心内容
该研究从温州蜜柑、瓦伦西亚橙和里斯本柠檬中分离了两个番茄红素β-环化酶基因CitLCYb1和CitLCYb2，通过序列分析、大肠杆菌功能互补实验及实时定量RT-PCR，系统比较了二者在柑橘类胡萝卜素积累中的差异作用。序列比对显示，两基因在不同品种间高度保守，温州蜜柑与瓦伦西亚橙中CitLCYb1和CitLCYb2的一致性分别为98%和97%，而两者在温州蜜柑内的氨基酸一致性仅53%。在大肠杆菌中单独表达时，CitLCYb1可将番茄红素完全转化为β-胡萝卜素，HPLC检测不到番茄红素残留峰，而CitLCYb2活性较低仍有番茄红素峰；与柠檬烯环化酶CitLCYe共表达时，CitLCYb2产生的α-胡萝卜素峰远高于β-胡萝卜素。表达分析表明，绿果期果皮中CitLCYb1和CitLCYe表达上升而CitLCYb2保持极低水平，橙果期CitLCYb1和CitLCYb2均达到最大值。该结果首次证明CitLCYb2在体外具备生成α-胡萝卜素的能力，但其在绿果期果皮中的低表达使其实际不参与α-胡萝卜素形成，而橙果期两基因的高表达才是β,β-黄素大量积累的关键，揭示了不同环化酶基因在柑橘不同发育阶段和组织的分工机制。
创新点
首次证明CitLCYb2与CitLCYe共表达时能产生α-胡萝卜素；结合表达分析揭示CitLCYb2在绿果期flavedo中表达极低，不参与α-胡萝卜素形成；阐明CitLCYb1和CitLCYb2在橙果期高表达对β,β-黄素积累的重要作用
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli XL1-Blue | 类胡萝卜素生物合成（异源） | CitLCYb1 | Lycopene β-cyclase 1 | 催化 | 在携带pACCRT-EIB的番茄红素积累菌株中，单独表达时完全转化番茄红素为β-胡萝卜素 |
| E. coli XL1-Blue | 类胡萝卜素生物合成（异源） | CitLCYb2 | Lycopene β-cyclase 2 | 催化 | 活性低于CitLCYb1，单独表达仍有番茄红素残留；与CitLCYe共表达时主要产生α-胡萝卜素 |
| E. coli XL1-Blue | 类胡萝卜素生物合成（异源） | CitLCYe | Lycopene ε-cyclase | 催化 | 与CitLCYb1或CitLCYb2共表达时，从番茄红素生成α-胡萝卜素 |
| 柑橘（Citrus unshiu, C. sinensis, C. limon） | 类胡萝卜素生物合成 | CitLCYb1 | Lycopene β-cyclase 1 | 催化 | 果实成熟期表达分析：绿果期flavedo中表达上升，橙果期达最大值；汁囊中表达持续增加 |
| 柑橘（Citrus unshiu, C. sinensis, C. limon） | 类胡萝卜素生物合成 | CitLCYb2 | Lycopene β-cyclase 2 | 催化 | 绿果期flavedo中表达极低，橙果期达最大值；温州蜜柑中表达量显著高于其他品种 |
| 柑橘（Citrus unshiu, C. sinensis, C. limon） | 类胡萝卜素生物合成 | CitLCYe | Lycopene ε-cyclase | 催化 | 绿果期flavedo中高表达，橙果期表达显著降低；汁囊中几乎不表达 |
关键发现
- 三种柑橘中CitLCYb1和CitLCYb2氨基酸序列高度一致：温州蜜柑与瓦伦西亚橙的一致性分别为98%和97%，温州蜜柑与里斯本柠檬分别为96%和93%
- CitLCYb1与CitLCYb2在温州蜜柑中一致性为53%，去除51残基的转运肽后为83%，蛋白分子量均约56 kDa。大肠杆菌功能分析表明，单独表达CitLCYb1时番茄红素完全转化为β-胡萝卜素（HPLC检测不到番茄红素峰），而CitLCYb2活性较低（仍有番茄红素峰）
- 与CitLCYe共表达时，CitLCYb1产生β-胡萝卜素和α-胡萝卜素，CitLCYb2产生的α-胡萝卜素峰远高于β-胡萝卜素。表达分析显示，绿果期flavedo中CitLCYb1和CitLCYe表达升高而CitLCYb2保持低水平
- 橙果期CitLCYb1和CitLCYb2表达达到最大值，CitLCYe显著降低
- 汁囊中CitLCYb1和CitLCYb2在绿果期快速上升并在橙果期达到最大，且温州蜜柑中表达量远高于其他两个品种
研究结论
CitLCYb1和CitLCYb2均能催化番茄红素形成β-胡萝卜素，与CitLCYe共表达时可形成α-胡萝卜素；但CitLCYb2在绿果期flavedo中表达极低，因此不参与α-胡萝卜素生成。橙果期CitLCYb1和CitLCYb2的高表达促进β,β-黄素积累，两者在决定柑橘类胡萝卜素组成中发挥重要作用