Molecular characterization of the pentacyclic triterpenoid biosynthetic pathway in Catharanthus roseus
- 作者
- Lili Huang, Jia Li, Hechun Ye, Changfu Li, Hong Wang, Benye Liu, Yansheng Zhang
- 单位
- CAS Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Specialty Agriculture, Wuhan Botanical Garden, The Chinese Academy of Science, 430074 Wuhan, China; Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, The Chinese Academy of Science, 100093 Beijing, China; Graduate University of the Chinese Academy of Science, 100049 Beijing, China
- 杂志
- Planta（2012）
- DOI
- 10.1007/s00425-012-1712-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析长春花中五环三萜类化合物（熊果酸、齐墩果酸等）的生物合成途径，克隆并鉴定参与三萜骨架环化和C-28氧化的关键酶。
研究策略
基于长春花叶片表皮EST数据库筛选候选基因，利用RT-PCR/RACE/TAIL-PCR克隆全长cDNA；在酿酒酵母WAT11中进行异源表达，通过体内外酶活分析、GC-MS/LC-MS产物鉴定及QRT-PCR表达模式分析，验证基因功能。
核心内容
本研究从长春花叶片表皮EST数据库出发，利用RT-PCR、RACE及TAIL-PCR技术克隆了五环三萜生物合成途径的关键酶基因，并在酿酒酵母WAT11中异源表达，通过体内外酶活分析、GC-MS/LC-MS产物鉴定及QRT-PCR表达分析验证其功能。结果发现，CrAS是一种新型多功能2,3-氧化鲨烯环化酶，同时产生α-和β-香树脂醇，比例为2.5:1；CrAO（CYP716AL1）为多功能C-28氧化酶，可催化α-香树脂醇、β-香树脂醇及羽扇豆醇的C-28位三步连续氧化，分别生成熊果酸、齐墩果酸和桦木酸。酵母中共表达CrAS与CrAO时，熊果酸产量为0.1 mg/L，齐墩果酸为0.045 mg/L，比例约2.2:1，且约90%的三萜酸分泌至培养基中；共表达AtLUP1与CrAO则可合成桦木酸。基因表达分析显示二者均在叶片高水平表达，与长春花中熊果酸与齐墩果酸约3:1的积累比例一致。该研究首次鉴定了长春花中多功能环化酶与氧化酶，为微生物合成三萜类化合物提供了关键元件与基础。
创新点
首次从长春花中克隆并功能鉴定多功能2,3-氧化鲨烯环化酶CrAS（同时产生α-和β-香树脂醇，比例2.5:1）和多功能C-28氧化酶CrAO（CYP716AL1），并通过酵母共表达实现熊果酸、齐墩果酸和桦木酸的从头生物合成。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母WAT11 | 五环三萜生物合成途径（2,3-氧化鲨烯→香树脂醇→三萜酸） | CrAS | 2,3-氧化鲨烯环化酶（OSC） | 催化 | 来自长春花，同时产生α-香树脂醇和β-香树脂醇，比例2.5:1 |
| 酿酒酵母WAT11 | 五环三萜生物合成途径 | CrAO (CYP716AL1) | 细胞色素P450 C-28氧化酶 | 催化 | 来自长春花，催化α-香树脂醇、β-香树脂醇和羽扇豆醇C-28位的三步连续氧化 |
| 酿酒酵母WAT11 | 五环三萜生物合成途径 | AtLUP1 | 羽扇豆醇合酶 | 催化 | 来自拟南芥，与CrAO共表达产生桦木酸 |
关键发现
- CrAS为新型多功能OSC，产生α-香树脂醇和β-香树脂醇的比例为2.5:1
- CrAO（CYP716AL1）可催化α-香树脂醇、β-香树脂醇和羽扇豆醇C-28位的三步连续氧化，分别生成熊果酸、齐墩果酸和桦木酸
- 酵母共表达CrAS和CrAO时，熊果酸产量为0.1 mg/L，齐墩果酸产量为0.045 mg/L（比例2.2:1）
- 酵母共表达AtLUP1和CrAO可产生桦木酸（产量低于0.1 mg/L）
- 约90%的三萜酸分泌到培养基中
- 长春花中熊果酸与齐墩果酸的比例约为3:1
- CrAS和CrAO均在叶片中高水平表达。
研究结论
CrAS和CrAO是长春花五环三萜酸生物合成的关键酶，其表达模式与熊果酸和齐墩果酸的积累一致；本研究为利用合成生物学方法在微生物中生产三萜类化合物提供了新元件和基础。