高级醇 · 代谢工程文献库

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Promoter analysis reveals cis-regulatory motifs associated with the expression of the WRKY transcription factor CrWRKY1 in Catharanthus roseus

作者
Zhirong Yang, Barunava Patra, Runzhi Li, Sitakanta Pattanaik, Ling Yuan
单位
Institute of Molecular Agriculture and Bioenergy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China; Department of Biochemistry, College of Arts and Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China; Department of Plant and Soil Sciences, Kentucky Tobacco Research and Development Center, University of Kentucky, Lexington, KY 40546, USA
杂志
Planta（2013）
DOI
10.1007/s00425-013-1949-2
所属领域
代谢工程
关键词
Catharanthus roseusHairy rootsTerpenoid indole alkaloidsWRKY transcription factor
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解决的核心问题

明确CrWRKY1转录因子启动子中的关键顺式调控元件及其在茉莉酸甲酯（MJ）响应和萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成调控中的作用

研究策略

通过基因组步移分离CrWRKY1启动子，利用5' RACE确定转录起始位点，结合5'/3'缺失分析、点突变和GUS报告基因分析，在长春花原生质体、转基因毛状根和异源烟草中表征启动子活性，并通过MJ处理鉴定响应区域

研究路线图

100%
研究问题：CrWRKY1启动子中关键顺式元件及其在MJ响应和TIA调控中的作用
策略：基因组步移分离启动子 + 5' RACE + 缺失/突变 + GUS报告分析
分离CrWRKY1启动子并定位转录起始位点（-113 bp处）
5'/3'缺失分析：鉴定关键活性区域
点突变：as-1元件与CT-rich基序功能验证
长春花原生质体 + 毛状根 + 异源烟草验证
发现双as-1+CT-rich协同调控；MJ响应定位于-230~-93 bp
缺失/突变使活性下降80-90%；MJ诱导响应消失
结论：多重元件组合调控启动子，可作工具分离新TIA转录因子
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核心内容

该研究对长春花中调控萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的转录因子CrWRKY1启动子进行了功能解析。通过基因组步移分离启动子，利用5' RACE确定转录起始位点位于翻译起始密码子上游113 bp处，并构建系列5'/3'缺失和点突变体，结合GUS报告基因在长春花原生质体、转基因毛状根及异源烟草中表征活性。结果显示，缺失至-140 bp使启动子活性降低20%，缺失至-93 bp活性降至原来的约2.5倍以下；突变两个重叠的as-1基序或CT-rich基序使活性降至野生型的25–35%，双突变则使活性丧失超过90%，表明这些元件协同调控基础表达。MJ响应元件定位于-230至-93 bp区域，删除该区域后茉莉酸甲酯诱导效应完全消失。该启动子可在天然及异源系统中驱动表达，且未含W-box基序，其组合调控机制为分离TIA网络中新的调控转录因子提供了有效工具。

创新点

首次功能表征CrWRKY1启动子；发现两个重叠的as-1元件与CT-rich基序协同调控启动子活性；定位MJ响应区域至-230至-93 bp；揭示启动子可作为工具分离新的TIA调控转录因子

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Catharanthus roseus (长春花) 原生质体和转基因毛状根 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 CrWRKY1 CrWRKY1 转录因子 调控 WRKY家族III亚组成员，正向调控TIA生物合成；启动子关键元件包括as-1和CT-rich
Catharanthus roseus (长春花) 和 Nicotiana tabacum (烟草) 转基因体系 TIA生物合成/异源表达报告系统 GUS (uidA) β-葡萄糖醛酸酶 催化 作为报告基因，用于CrWRKY1启动子缺失和突变分析

关键发现

  1. 转录起始位点位于翻译起始密码子上游113 bp的胸腺嘧啶残基
  2. 缺失至-140 bp使启动子活性降低20%，缺失至-93 bp使活性降低2.5倍
  3. 突变两个重叠as-1基序（M3）或CT-rich基序（M5）使活性降至野生型的25-35%，双突变（M3+M5）使活性丧失超过90%
  4. 在转基因毛状根中，delC（-140至+113）的GUS转录水平约为野生型的40%，delD和delE的表达降低80-90%
  5. 在转基因烟草中，delC、delD或delE的GUS表达比野生型低50-80%
  6. MJ处理可诱导启动子适度表达，当删除-93至+113区域（delD）后MJ响应完全消失，表明MJ响应元件位于-230至-93 bp区域
  7. CrWRKY1启动子中未发现W-box基序

研究结论

CrWRKY1启动子的活性由多个顺式元件（特别是两个重叠as-1元件和CT-rich基序）组合调控，且MJ响应依赖于-230至-93区域。该启动子可在天然及异源系统中驱动表达，有望用于分离TIA生物合成调控网络中新的转录因子。