Cloning and functional characterization of two monoterpene acetyltransferases from glandular trichomes of L. x intermedia.
- 作者
- Lukman S. Sarker, Soheil S. Mahmoud
- 杂志
- Planta（2015）
- DOI
- 10.1007/s00425-015-2325-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并功能表征薰衣草（Lavandula x intermedia）腺毛中负责合成单萜乙酸酯的两个乙酰转移酶基因，揭示单萜酯生成的分子机制。
研究策略
从L. x intermedia腺毛cDNA文库中筛选乙酰转移酶候选基因，通过序列分析、组织表达谱筛选出LiAAT-3和LiAAT-4，利用大肠杆菌异源表达并纯化重组蛋白，通过GC-MS检测酶活，测定动力学参数并进行系统发育分析。
核心内容
从薰衣草（Lavandula x intermedia）腺毛cDNA文库中筛选并克隆了两个单萜乙酰转移酶基因LiAAT-3和LiAAT-4，经大肠杆菌异源表达、纯化后获得重组蛋白，其分子量分别约47和49 kDa。酶动力学分析显示，LiAAT-4对lavandulol、geraniol和nerol的Km分别为0.354、0.279和0.113 mM，催化效率（kcat/Km）分别达0.85、0.54和0.4 mM⁻¹min⁻¹，比LiAAT-3高出2.9至7.7倍；两者均以lavandulol为最适底物，且都不能将linalool转化为乙酸芳樟酯。qPCR结果表明，LiAAT-3在L. angustifolia和L. x intermedia的花和腺毛中分别上调118/5866倍和1.3/49倍，LiAAT-4分别上调83/1601倍和7.5/345倍。这两个酶是薰衣草单萜乙酸酯合成的关键醇乙酰转移酶，其克隆为通过代谢工程和定向育种改良薰衣草精油品质提供了重要基因资源。
创新点
首次从L. x intermedia中克隆并功能表征两个单萜乙酰转移酶LiAAT-3和LiAAT-4；发现两者均优先利用lavandulol为底物，且不能催化linalool生成乙酸芳樟酯，提示存在其他芳樟醇乙酰转移酶。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌BL21(DE3)plysS | 单萜乙酸酯生物合成 | LiAAT-3 | LiAAT-3蛋白 | 催化 | 以乙酰CoA为酰基供体，催化lavandulol、geraniol、nerol生成对应乙酸酯，不能催化linalool；动力学参数见正文。 |
| 大肠杆菌BL21(DE3)plysS | 单萜乙酸酯生物合成 | LiAAT-4 | LiAAT-4蛋白 | 催化 | 以乙酰CoA为酰基供体，催化lavandulol、geraniol、nerol生成对应乙酸酯，不能催化linalool；催化效率优于LiAAT-3。 |
关键发现
- LiAAT-3和LiAAT-4重组蛋白分子量分别约47和49 kDa。LiAAT-3对lavandulol、geraniol、nerol的Km分别为1.046、1.31、0.87 mM，Vmax分别为92.13、81.07、15.02 pkat/mg
- LiAAT-4对应Km分别为0.354、0.279、0.113 mM，Vmax分别为105.1、52.17、15.8 pkat/mg。催化效率（kcat/Km）LiAAT-3为0.27、0.19、0.052 mM⁻¹min⁻¹（lavandulol、geraniol、nerol），LiAAT-4为0.85、0.54、0.4 mM⁻¹min⁻¹。LiAAT-4催化效率比LiAAT-3高2.9-7.7倍
- lavandulol为最适底物。两者均不能将linalool转化为乙酸芳樟酯。qPCR显示LiAAT-3在L. angustifolia和L. x intermedia的花和腺毛中分别上调118/5866倍和1.3/49倍
- LiAAT-4分别上调83/1601倍和7.5/345倍。
研究结论
LiAAT-3和LiAAT-4是负责薰衣草单萜乙酸酯合成的醇乙酰转移酶，可催化香叶醇、薰衣草醇和橙花醇的乙酰化，但不催化芳樟醇。这些酶的克隆为通过代谢工程和靶向育种改良薰衣草精油品质提供了基因资源。