Identification of a novel hedgecaryol synthase gene isolated from Camellia brevistyla flowers and floral scent of Camellia cultivars
- 作者
- Jun-ichiro Hattan, Kazutoshi Shindo, Tomoko Ito, Yurica Shibuya, Arisa Watanabe, Chie Tagaki, Fumina Ohno, Tetsuya Sasaki, Jun Ishii, Akihiko Kondo, Norihiko Misawa
- 单位
- Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University; Department of Food and Nutrition, Japan Women's University; Industrial Research Institute of Ishikawa; Organization of Advanced Science and Technology, Kobe University; Department of Chemical Science and Engineering, Graduate School of Engineering, Kobe University
- 杂志
- Planta（2016）
- DOI
- 10.1007/s00425-015-2454-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定山茶属花卉中负责产生倍半萜香气的新型萜烯合酶基因及其功能，具体是从香花短柱茶（Camellia brevistyla）中克隆一个全新的hedycaryol合酶基因CbTps1，并解析其表达特异性，同时探究不同山茶品种的花香成分。
研究策略
利用GC-MS比较多种山茶花的花香成分，选取产倍半萜的C. brevistyla为材料，通过简并PCR和RACE克隆全长TPS cDNA；将基因在携带甲羟戊酸途径工程的大肠杆菌中异源表达，以乙酰乙酸锂为底物进行发酵；用GC-MS、NMR对产物进行结构鉴定；通过系统发育和RT-PCR分析基因进化位置和组织表达模式。
核心内容
本研究从香花短柱茶（Camellia brevistyla）花中克隆到一个新的倍半萜合酶基因CbTps1，并通过GC-MS比较多种山茶花的花香成分，选取产倍半萜的C. brevistyla为材料，利用简并PCR和RACE技术获得全长cDNA。将该基因在携带甲羟戊酸途径工程质粒pAC-Mev/Scidi/Aacl的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)中异源表达，以乙酰乙酸锂为底物发酵，从1 L培养物中纯化获得13.2 mg产物，经GC-MS和NMR鉴定为hedycaryol。CbTPS1编码554个氨基酸（64.0 kDa），与猕猴桃芳樟醇合酶有71%同一性，在系统发育树上形成独立分支。RT-PCR显示该基因仅在花中表达，叶和茎中不表达。花香分析表明C. brevistyla和'Koto-no-kaori'的挥发性萜烯占总花香成分30%以上。此外还从Camellia saluenensis中分离了芳樟醇合酶基因CsTps1。该研究首次鉴定山茶属hedycaryol合酶基因，为山茶花香分子机制及利用工程大肠杆菌生产hedycaryol/elemol奠定了基础。
创新点
首次从山茶属中克隆并功能鉴定hedycaryol合酶基因CbTps1；该基因在系统发育树上形成独立分支，为新的萜烯合酶；运用NMR宽峰特征和热重排产物elemol鉴定不稳定的hedycaryol；同时从Camellia saluenensis分离了芳樟醇合酶基因CsTps1；证明CbTps1在花中特异表达。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3) | 甲羟戊酸(MVA)途径/倍半萜生物合成 | CbTps1 | CbTPS1（hedycaryol合酶） | 催化 | 从Camellia brevistyla花中克隆，全长554 aa，分子量64.0 kDa；催化FPP环化生成hedycaryol，产物经热重排生成elemol |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3) | 甲羟戊酸(MVA)途径/单萜生物合成 | CsTps1 | CsTPS1（芳樟醇合酶） | 催化 | 从Camellia saluenensis花中克隆，全长575 aa，分子量66.1 kDa，pI 6.03；催化GPP生成linalool |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3) | 甲羟戊酸(MVA)途径 | MVA基因簇、Scidi、Aacl（质粒pAC-Mev/Scidi/Aacl） | MVA途径酶类、IPP异构酶、乙酰乙酸-CoA连接酶 | 催化 | 来自Streptomyces sp. CL190的MVA途径基因簇，来自酿酒酵母的IPP异构酶基因（Scidi）及乙酰乙酸-CoA连接酶基因（Aacl），使大肠杆菌可利用乙酰乙酸锂（LAA）合成IPP/DMAPP前体，用于萜烯生产 |
关键发现
- 从重组大肠杆菌1 L培养物中纯化获得hedycaryol
- 2 mg；CbTps1编码554个氨基酸（64.0 kDa），CsTps1编码575个氨基酸（66.1 kDa，pI
- 03）；CbTPS1与Actinidia芳樟醇合酶有71%同一性；GC-MS显示CbTPS1产物主峰与elemol标准品重合（保留时间36.9 min，m/z 222），NMR宽峰证实hedycardyol构象平衡；花香分析中，C. brevistyla和'Koto-no-kaori'的挥发性萜烯占总花香成分30%以上，C. brevistyla含有α-bisabolene等倍半萜，而C. japonica栽培种主要含linalool；RT-PCR表明CbTps1仅在花中表达，叶和茎不表达；表达系统通过pAC-Mev/Scidi/Aacl质粒提供MVA途径，并添加1 mg/ml乙酰乙酸锂和25 μM IPTG诱导。
研究结论
CbTps1鉴定为hedycaryol合酶基因，花特异性表达，提示hedycaryol在吸引传粉昆虫中起作用；CsTps1为芳樟醇合酶基因。研究为山茶花香分子机制及利用代谢工程大肠杆菌生产hedycaryol/elemol提供了基础。