In vivo characterization of key iridoid biosynthesis pathway genes in catnip (Nepeta cataria)
- 作者
- Lira Palmer, Ling Chuang, Marlen Siegmund, Maritta Kunert, Kotaro Yamamoto, Prashant Sonawane, Sarah E. O'Connor
- 杂志
- Planta（2022）
- DOI
- 10.1007/s00425-022-04012-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
尽管荆芥内酯生物合成相关酶已在体外进行生化表征，但这些酶在植物体内的功能尚未得到验证。本研究旨在通过病毒诱导基因沉默（VIGS）在荆芥（Nepeta cataria）体内验证 GES、ISY 和 MLPL 等关键酶的功能。
研究策略
利用带有 ChlH 可视化标记的烟草脆裂病毒（TRV）VIGS 系统，在 Nepeta cataria 中对 GES、ISY、MLPL 进行共沉默，通过 GC-MS 和 LC-MS 分析荆芥内酯及代谢物变化，结合 qPCR 验证基因表达下调。
研究路线图
核心内容
本研究利用带有ChlH可视化标记的烟草脆裂病毒VIGS系统，在猫薄荷（Nepeta cataria）体内对荆芥内酯生物合成途径的关键酶基因GES、ISY和MLPL进行共沉默，并通过GC-MS、LC-MS及qPCR验证其功能。结果表明，仅沉默ChlH不影响总荆芥内酯含量，而ChlH-GES共沉默显著降低总荆芥内酯；GES沉默显著降低总含量及所有异构体，ISY沉默显著降低总荆芥内酯且(S)-cis,trans和(S)-cis,cis异构体明显下降，MLPL沉默仅显著降低(S)-cis,trans异构体。qPCR确认三个基因mRNA水平显著下调但未完全沉默。ISY沉默导致推测为戊糖缀合羟基香叶醛的化合物上调9倍，GES沉默使1,5,9-epi-deoxyloganic acid下调1.27倍。NEPS因编码区序列相似性（70-87%同一性）无法通过该方法验证。该研究首次在体内证实GES、ISY和MLPL参与荆芥内酯生物合成，支持了体外研究结果，并建立了可用于萜类代谢调控与转运机制研究的VIGS体系。
创新点
['首次在体内验证了 Nepeta cataria 中荆芥内酯生物合成途径关键酶 GES、ISY、MLPL 的功能', '采用双基因沉默（ChlH 可视化标记与靶基因共沉默）策略，提高 VIGS 效率并实现精确组织取样', '发现 ISY 沉默导致衍生化香叶醛代谢物积累（9 倍上调）', '发现 GES 沉默导致糖基化环烯醚萜 1,5,9-epi-deoxyloganic acid 显著下调']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nepeta cataria (猫薄荷) | 荆芥内酯生物合成途径 | GES | Geraniol synthase | 催化 | 催化 GPP 生成香叶醇，是途径第一步；VIGS 沉默显著降低总荆芥内酯及所有异构体。 |
| Nepeta cataria (猫薄荷) | 荆芥内酯生物合成途径 | ISY | Iridoid synthase | 催化 | 催化 8-氧代香叶醛还原为反应性烯醇中间体；沉默导致总荆芥内酯降低，并积累衍生化前体。 |
| Nepeta cataria (猫薄荷) | 荆芥内酯生物合成途径 | MLPL | Major-latex protein-like enzyme | 催化 | 催化烯醇环化为 (S)-cis,trans 荆芥内酯醇；沉默仅降低 (S)-cis,trans 荆芥内酯。 |
| Nepeta cataria (猫薄荷) | 荆芥内酯生物合成途径 | NEPS1 | Short-chain alcohol dehydrogenase-like enzyme | 催化 | 氧化荆芥内酯醇为荆芥内酯；因序列相似性未能单独沉默。 |
| Nepeta cataria (猫薄荷) | 荆芥内酯生物合成途径 | NEPS3 | Short-chain alcohol dehydrogenase-like enzyme | 催化 | 催化烯醇环化为 (S)-cis,cis 荆芥内酯醇；本研究中未成功沉默。 |
| Nepeta cataria (猫薄荷) | 荆芥内酯生物合成途径 | NEPS4 | Short-chain alcohol dehydrogenase-like enzyme | 催化 | 催化烯醇环化为 (S)-trans,cis 荆芥内酯醇；未成功沉默。 |
| Nepeta cataria (猫薄荷) | 荆芥内酯生物合成途径 | NEPS5 | Short-chain alcohol dehydrogenase-like enzyme | 催化 | 氧化荆芥内酯醇为荆芥内酯；未成功沉默。 |
| Nepeta cataria (猫薄荷) | 叶绿素生物合成途径 | ChlH | Magnesium chelatase subunit H | 催化 | 作为 VIGS 可视化标记，沉默导致光漂白表型；单独沉默不影响荆芥内酯含量。 |
关键发现
- 与空载体对照相比，仅沉默 ChlH 不改变总荆芥内酯含量；GES 单独沉默无显著差异，但 ChlH-GES 共沉默显著降低总荆芥内酯含量。与 ChlH 对照相比，GES 沉默显著降低总荆芥内酯含量及所有异构体；ISY 沉默显著降低总荆芥内酯，其中 (S)-cis,trans 和 (S)-cis,cis 异构体显著下降，而 (S)-trans,cis 无显著变化；MLPL 沉默仅显著降低 (S)-cis,trans 荆芥内酯，总含量无显著变化。qPCR 显示 ges、isy、mlpl 的 mRNA 水平显著降低，但未完全沉默。ISY 沉默组织中，一个 m/z
- 1561 的化合物（推测为甲酸加合物的戊糖缀合羟基香叶醛，C15H24O6-COOH 精确质量
- 1549，Δppm
- 56）上调 9 倍。1,5,9-epi-deoxyloganic acid 在 GES 沉默样品中显著下调
- 27 倍。NEPS 基因编码区核苷酸同一性为 70-87%，无法用编码区特异性沉默；靶向 3'UTR 未改变荆芥内酯含量。VIGS 效率从平均 25-32% 略有提高。
研究结论
本研究通过 VIGS 实验证实 GES、ISY 和 MLPL 在 Nepeta cataria 体内参与荆芥内酯的生物合成，支持了先前的体外研究结果。同时，ISY 沉默导致衍生化前体积累，进一步支持其在途径中的关键作用。NEPS 因序列相似性无法通过该方法验证，需要开发替代策略。该 VIGS 系统可用于未来研究 iridoid 代谢的调控和转运机制。