高级醇 · 代谢工程文献库

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High cell density culture with S. cerevisiae CEN.PK113-5D for IL-1β production: optimization, modeling, and physiological aspects

作者
Carmine Landi, Lucia Paciello, Elisabetta de Alteriis, Luca Brambilla, Palma Parascandola
单位
Dep. Ingegneria Industriale, Università Di Salerno; Dep. Biologia, Università degli Studi di Napoli "Federico II"; Dep. Biotecnologie e Bioscienze, Università Milano-Bicocca
杂志
Bioprocess and Biosystems Engineering（2014）
DOI
10.1007/s00449-014-1264-8
所属领域
代谢工程
关键词
Auxotrophic yeastsHigh cell density culturesMetabolic shiftS. cerevisiaeYeast growth modeling
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解决的核心问题

在低于临界比生长速率的条件下，酿酒酵母高密度补料分批培养中仍发生呼吸向发酵的代谢转向，导致生物量得率下降，尤其影响重组菌株生产IL-1β，需要优化流加策略并解析原因。

研究策略

以非转化和表达人IL-1β的酿酒酵母CEN.PK113-5D为对象，采用三种指数递增葡萄糖流加速率进行高密度补料分批培养，建立非结构化非分离模型描述底物消耗与产物积累，并测定乙酸、甘油、ROS、过氧化氢酶活性、细胞活力等生理指标。

研究路线图

100%
研究问题：高密度培养中酿酒酵母代谢转向，重组菌IL-1β产量受限
策略：三种指数流加速率进行高密度补料分批培养
关键改造：建立非结构化数学模型描述底物消耗与产物积累
关键改造：测定生理指标（乙酸、甘油、ROS、过氧化氢酶等）
结果：α=0.10时终密度最高，生物量得率下降至0.25 g/g
结果：重组菌乙醇积累显著，IL-1β产量恒为0.08 mg/g
结果：ROS最大占比21%，过氧化氢酶活性变化
结果：无质粒丢失，细胞死亡率低
结论：代谢转向非氧限制或氧化应激所致，机制待阐明
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核心内容

本研究以酿酒酵母CEN.PK113-5D及其表达人IL-1β的重组菌株为对象，系统考察了三种指数递增葡萄糖流加速率下的高密度补料分批培养，并建立非结构化非分离模型描述底物消耗与产物积累。结果显示，非转化菌在流加速率α=0.10 h⁻¹时获得最高终密度，而α=0.20 h⁻¹时仅为该值的60%，生物量得率从0.46 g/g降至0.25 g/g。重组菌在α=0.20 h⁻¹时终密度约40 g/L且14小时后骤降，但IL-1β产量始终稳定在0.08 mg/g细胞干重，最高体积产率0.30 g·L⁻¹·h⁻¹出现在α=0.16 h⁻¹。研究揭示了一个关键现象：即便比生长速率低于临界值，高密度培养中仍发生呼吸向发酵的代谢转向，且重组菌株更早、更显著。通过测定乙酸（最高仅0.351 mg/L）、ROS（最大占比21%）、过氧化氢酶活性及细胞活力等指标，排除了氧限制和氧化应激对代谢转向的主导作用。该结果表明高细胞密度下酵母生长能力下降、乙醇积累不可避免，异源蛋白表达加剧了代谢负担，但根本机制仍需进一步阐明。

创新点

揭示了在μ低于μcrit时仍出现代谢转向的现象，且重组菌株更早更显著；建立了包含葡萄糖对乙醇消耗抑制因子的数学模型；通过生理指标排除了氧限制和氧化应激对代谢转向的主导作用。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 葡萄糖代谢（有氧呼吸/发酵） — — — 尿嘧啶营养缺陷型菌株，Mata ura3-52 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8c SUC2
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 异源蛋白生产 IL1B IL-1β — 人白细胞介素-1β，生长偶联型产物，造成代谢负担
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 分泌途径/细胞壁代谢 PIR4 Pir4-IL1β融合蛋白 转运 PIR4部分序列与IL-1β融合，促进融合蛋白分泌至培养基
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D 嘧啶合成 URA3 — 催化 乳清苷酸脱羧酶，作为质粒选择标记

关键发现

  1. 非转化菌在α=0.10 h^-1时终密度最高，α=0.20 h^-1时仅为最高值的60%
  2. 生物量得率从0.46 g/g降至0.25 g/g
  3. 重组菌在α=0.20 h^-1时终密度约40 g/L并在14小时后骤降
  4. IL-1β产量恒为0.08 mg/g细胞干重，最高体积产率0.30 g·L^-1·h^-1（α=0.16 h^-1）
  5. 重组菌在所有α值下均产生乙醇
  6. 乙酸最高仅0.351 mg/L
  7. ROS最大占比21%
  8. 细胞死亡率低
  9. 无质粒丢失
  10. 过氧化氢酶活性在非转化菌低流加速率下最高。

研究结论

高细胞密度下酵母生长能力不可避免下降，导向乙醇积累，重组菌株因异源蛋白表达造成代谢负担而更明显；该代谢转向并非由培养氧合不足或氧化应激引起，其根本机制仍需进一步阐明。