Insights into the simultaneous utilization of glucose and glycerol by Streptomyces albulus M-Z18 for high ε-poly-L-lysine productivity
- 作者
- Xin Zeng, Junjie Zhao, Xusheng Chen, Zhonggui Mao, Wenyun Miao
- 单位
- College of Life Sciences, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China; The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, 1800 Lihu Road, Wuxi 214122, Jiangsu, China; Family Planning Service Center, Rizhao Maternal and Child Care Service Hospital, Rizhao 276826, China
- 杂志
- Bioprocess and Biosystems Engineering（2017）
- DOI
- 10.1007/s00449-017-1832-9
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明S. albulus M-Z18在葡萄糖-甘油混合碳源中同时利用两种底物并显著提高ε-聚-L-赖氨酸（ε-PL）生产率和细胞生长的分子机制，即为什么混合碳源优于单一碳源以及微生物如何实现同时利用。
研究策略
使用转录组测序（RNA-seq）比较单葡萄糖、单甘油和葡萄糖-甘油混合碳源培养下的基因转录差异；用qRT-PCR验证关键基因转录水平；通过外源添加木糖醇和柠檬酸作为辅助碳源，验证细胞对核糖-5-磷酸和EMP途径碳骨架的需求。
核心内容
该研究以白色链霉菌M-Z18为对象，通过转录组测序和qRT-PCR比较单一葡萄糖、单一甘油及葡萄糖-甘油混合碳源下的基因表达差异，并结合外源添加木糖醇和柠檬酸的验证实验，阐明混合碳源显著提高ε-聚-L-赖氨酸（ε-PL）生产率的分子机制。结果显示，混合碳源（30 g/L葡萄糖+30 g/L甘油）下ε-PL生产率较单葡萄糖和单甘油分别提高1.84倍和1.35倍，比生长速率分别提高1.21倍和1.30倍。转录组分析表明，单甘油培养中葡萄糖激酶基因转录水平比单葡萄糖低2.9倍，而单甘油中甘油激酶基因转录水平是单葡萄糖的20.7倍，但混合碳源中两种底物的转运和利用基因均未受到抑制，即不存在葡萄糖效应。代谢通路分析显示，混合碳源中葡萄糖主要经磷酸戊糖途径提供核糖-5-磷酸，甘油则主要经EMP途径提供碳骨架，两者协同饱和EMP代谢能力并补充ε-PL合成所需的前体和ATP。外源木糖醇仅提升单甘油培养的比生长速率1.9倍，而柠檬酸仅在单一碳源中增强ε-PL比形成速率，进一步证实了上述互补机制。该研究揭示了双底物协同利用的代谢分工策略，为通过混合碳源发酵提高氨基酸聚合物产量提供了理论依据。
创新点
揭示S. albulus M-Z18中葡萄糖和甘油同时利用时不存在‘葡萄糖效应’的转录相互抑制；发现单甘油培养中细胞存在核糖-5-磷酸不足，可通过葡萄糖或木糖醇缓解；证明混合碳源中葡萄糖主要走PPP途径，甘油主要走EMP途径，两者互补提供充足碳骨架，饱和EMP代谢能力并补充ε-PL合成所需前体和能量。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces albulus M-Z18 | 葡萄糖转运 | MAGL001888 | PTS系统葡萄糖特异IIA组分 | 转运 | 混合碳源培养中转录水平未受甘油添加抑制（RPKM 1335.77 vs 775.27） |
| Streptomyces albulus M-Z18 | 葡萄糖磷酸化 | MAGL008383 | 葡萄糖激酶 | 催化 | 单葡萄糖中RPKM 111.94，单甘油中38.58，混合碳源中71.91 |
| Streptomyces albulus M-Z18 | 甘油转运 | MAGL002354 | 甘油摄取促进蛋白 | 转运 | 单甘油中RPKM 726.37，混合碳源中685.03 |
| Streptomyces albulus M-Z18 | 甘油磷酸化 | MAGL002355 | 甘油激酶 | 催化 | 单甘油中RPKM 830.10，单葡萄糖中40.02，混合碳源中882.31 |
| Streptomyces albulus M-Z18 | 磷酸戊糖途径（PPP） | — | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | qRT-PCR验证其在单甘油和混合碳源中转录上调 |
| Streptomyces albulus M-Z18 | 磷酸戊糖途径（PPP） | MAGL003375 | 核糖-5-磷酸异构酶 | 催化 | 单甘油中转录上调，混合碳源中进一步增强 |
| Streptomyces albulus M-Z18 | 糖酵解（EMP） | — | 6-磷酸果糖激酶 | 催化 | 单甘油培养中转录上调，混合碳源中下调 |
| Streptomyces albulus M-Z18 | 糖酵解/回补途径 | — | 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 | 催化 | 混合碳源中转录水平最高 |
| Streptomyces albulus M-Z18 | 糖酵解/丙酮酸代谢 | — | 丙酮酸激酶 | 催化 | 混合碳源中转录水平最高 |
| Streptomyces albulus M-Z18 | 木酮糖利用 | — | 木酮糖激酶 | 催化 | 单甘油中转录上调，葡萄糖或混合碳源添加后下调 |
关键发现
- 混合碳源（30 g/L葡萄糖+30 g/L甘油）相比单葡萄糖和单甘油，ε-PL生产率分别提高1.84倍和1.35倍，比生长速率分别提高1.21倍和1.30倍，分批发酵时间缩短20%以上。转录组分析显示，与单甘油相比，单葡萄糖中葡萄糖激酶基因转录水平高2.9倍（RPKM
- 94 vs
- 58），而单甘油中甘油激酶基因转录水平比单葡萄糖高20.7倍（RPKM
- 10 vs
- 02）；混合碳源中甘油转运和利用基因未受葡萄糖抑制，葡萄糖PTS基因也未受甘油抑制。外源木糖醇添加使单甘油培养的比生长速率提高1.9倍，但在混合碳源中几乎无促进；外源柠檬酸添加显著提高单一碳源的ε-PL比形成速率，但在混合碳源中无提升且柠檬酸几乎不被消耗。混合碳源增强PPP途径（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、核糖-5-磷酸异构酶）和EMP/回补途径（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶）基因转录，同时下调6-磷酸果糖激酶转录。
研究结论
在S. albulus M-Z18中，葡萄糖和甘油的同时利用不存在碳分解代谢物阻遏，二者以协同互补方式被代谢：葡萄糖主要经PPP途径快速提供核糖-5-磷酸并部分进入EMP，甘油主要经EMP提供碳骨架；混合碳源能提供充足的碳骨架饱和EMP代谢能力，从而有效补充ε-PL合成所需的L-赖氨酸前体和ATP，最终提高ε-PL生产率和细胞生长。