Biochemical characterization and high-level production of oxidized polyvinyl alcohol hydrolase from Sphingopyxis sp. 113P3 expressed in methylotrophic Pichia pastoris
- 作者
- Yu Yang, Long Liu, Jianghua Li, Guocheng Du, Jian Chen
- 单位
- Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University; Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University; National Engineering of Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University
- 杂志
- Bioprocess and Biosystems Engineering（2013）
- DOI
- 10.1007/s00449-013-1047-7
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
氧化聚乙烯醇水解酶（OPH）在大肠杆菌中表达量低、催化效率差，难以满足工业应用需求，需要开发高效的异源表达系统。
研究策略
将Sphingopyxis sp. 113P3的oph基因按毕赤酵母密码子偏好性进行优化，克隆至pPIC9K载体，转化毕赤酵母GS115，经甲醇诱导在3 L生物反应器中进行高细胞密度发酵，并纯化表征重组OPH。
核心内容
针对氧化聚乙烯醇水解酶（OPH）在大肠杆菌中表达量低、催化效率差的问题，本研究将来源于Sphingopyxis sp. 113P3的oph基因按毕赤酵母密码子偏好性优化后克隆至pPIC9K载体，转化毕赤酵母GS115，并在3 L生物反应器中通过甲醇诱导进行高细胞密度发酵。结果显示，经88 h诱导后重组OPH最高活性达68.4 U/mL，为摇瓶培养的10倍，最终生物量151 g/L，体积产率777 U/L/h；纯化后比活力239 U/mg。重组酶最适pH 8.0、最适温度45°C，在pH 5.0–8.5及低于45°C时稳定。动力学分析表明其Km为0.97 mM，Kcat/Km达598 mM⁻¹ s⁻¹，催化效率较大肠杆菌来源酶（140 mM⁻¹ s⁻¹）提高4.27倍。PMSF及Hg²⁺、Cr²⁺、Fe²⁺显著抑制酶活，Mn²⁺有轻微激活作用。该研究首次在毕赤酵母中实现OPH高水平分泌表达，产量与催化效率均显著提升，且工艺易于放大，为OPH的工业应用提供了可行方案。
创新点
首次在毕赤酵母中实现OPH的高水平表达，获得了迄今报道的最高OPH活性（68.4 U/mL）；通过密码子优化和低温诱导（22°C）显著提高了产量；重组OPH的催化效率较大肠杆菌来源的酶提高4.27倍。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 聚乙烯醇（PVA）降解途径 | oph | 氧化聚乙烯醇水解酶（OPH） | 催化 | 基因序列经毕赤酵母密码子优化，pPIC9K载体表达，分泌到胞外，最高活性68.4 U/mL |
| Escherichia coli | 聚乙烯醇（PVA）降解途径 | oph | 氧化聚乙烯醇水解酶（OPH） | 催化 | 先前研究中的表达宿主，催化效率较低，作为对比 |
关键发现
- 重组OPH在3 L发酵罐中经88 h甲醇诱导后最高活性达68.4 U/mL，为摇瓶培养的10倍
- 最终生物量为151 g/L，体积产率777 U/L/h
- 总蛋白量2.30 g/L，纯化后比活力239 U/mg。最适pH为8.0，最适温度45°C，pH 5.0-8.5范围内稳定，温度低于45°C稳定，47.5°C下活性半衰期5 h。动力学参数Km=0.97 mM，Kcat=580 s^-1，Kcat/Km=598 mM^-1 s^-1，较大肠杆菌表达的重组OPH（140 mM^-1 s^-1）高4.27倍。1 mM PMSF、Hg2+、Cr2+、Fe2+强烈抑制酶活，Mn2+有轻微激活作用。
研究结论
毕赤酵母是表达OPH的优良宿主，可高效分泌具有正确折叠和较高催化效率的重组酶，且工艺易于放大、纯化经济，为OPH的工业应用提供了可行方案。