The isolation and characterization of dammarenediol synthase gene from Panax quinquefolius and its heterologous co-expression with cytochrome P450 gene PqD12H in yeast
- 作者
- Le Wang, Shou-Jing Zhao, Hao-Jie Cao, Yao Sun
- 杂志
- Functional & Integrative Genomics（2014）
- DOI
- 10.1007/s10142-014-0384-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从西洋参（Panax quinquefolius）中克隆并鉴定达玛烯二醇合酶基因（PqDS），并通过在酵母中与细胞色素P450基因PqD12H异源共表达，实现原人参二醇的体外生产。
研究策略
采用简并引物和RACE技术从西洋参毛状根中克隆PqDS基因；通过序列比对和系统发育分析鉴定其功能；利用RT-PCR分析MeJA诱导下的转录水平；在酵母WAT21中异源表达PqDS验证其催化产物；在西洋参毛状根中过表达PqDS以提高人参皂苷含量；构建共表达PqDS和PqD12H的重组酵母，通过LC/APCIMS检测原人参二醇的产生。
核心内容
该研究从西洋参毛状根中克隆了达玛烯二醇合酶基因PqDS，其全长2319 bp，开放阅读框2310 bp，编码769个氨基酸，预测分子量88.4 kDa。序列比对显示其推导氨基酸序列与人参PgDDS和三七PnDS的相似性分别达99.61%和99.59%。经MeJA诱导24小时后PqDS转录水平最高，表明其参与茉莉酸甲酯介导的人参皂苷生物合成调控。在酵母WAT21中异源表达PqDS后，通过LC/APCIMS检测到达玛烯二醇-II，证实该基因编码达玛烯二醇合酶。在西洋参毛状根中过表达PqDS可使总人参皂苷含量从2.99 mg/g DW提高至3.44 mg/g DW，其中人参皂苷Rf含量提高1.74倍，Rg1、Rb1等含量也均有显著提升。进一步构建共表达PqDS与细胞色素P450基因PqD12H的重组酵母，成功检测到原人参二醇，产量约为18.09 μg/g FW。该研究首次从西洋参中克隆并鉴定了达玛烯二醇合酶基因，并在酵母中实现原人参二醇的异源生产，为人参皂苷类化合物的体外规模化制备提供了可行策略。
创新点
首次从西洋参中克隆并获得达玛烯二醇合酶基因PqDS（GenBank登录号KC316048）；证明PqDS是达玛烯二醇合酶；通过酵母中共表达PqDS与PqD12H成功生产原人参二醇；过表达PqDS可显著提高西洋参毛状根中多种人参皂苷含量。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Panax quinquefolius hairy root | 人参皂苷生物合成途径 | PqDS | 达玛烯二醇合酶 | 催化 | 催化2,3-氧化鲨烯环化生成达玛烯二醇-II |
| Panax quinquefolius hairy root | 人参皂苷生物合成途径 | PqD12H | 原人参二醇合酶（细胞色素P450） | 催化 | 过表达PqDS可上调其转录，催化达玛烯二醇-II C-12位羟化生成原人参二醇 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT21 | 人参皂苷生物合成途径 | PqDS | 达玛烯二醇合酶 | 催化 | 异源表达产生达玛烯二醇-II |
| Saccharomyces cerevisiae WAT21 | 人参皂苷生物合成途径 | PqD12H | 原人参二醇合酶（细胞色素P450） | 催化 | 与PqDS共表达，将达玛烯二醇-II转化为原人参二醇 |
关键发现
- 克隆的PqDS基因全长2319 bp，ORF为2310 bp，编码769个氨基酸，预测分子量88.4 kDa
- 其推导氨基酸序列与Panax ginseng的PgDDS和Panax notoginseng的PnDS相似性分别为99.61%和99.59%。MeJA处理24 h后PqDS转录水平最高。在酵母中异源表达PqDS后，LC/APCIMS检测到达玛烯二醇-II，保留时间59.87 min，质谱碎片m/z 409 [M-2H2O+H]+和427 [M-H2O+H]+。过表达PqDS的转基因西洋参毛状根中，人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc含量分别提高1.21、1.19、1.74、1.32、1.30、1.49倍，总人参皂苷含量从2.99 mg/g DW提高到3.44 mg/g DW（提高1.15倍）。在共表达PqDS和PqD12H的酵母中，检测到原人参二醇，产量约为18.09 μg/g FW。
研究结论
成功从西洋参中克隆并鉴定了达玛烯二醇合酶基因PqDS，并在酵母中与PqD12H共表达实现了原人参二醇的异源生产，为体外大量制备原人参二醇及人参皂苷生物合成研究提供了新策略。