高级醇 · 代谢工程文献库

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Construction of Novel Chloroplast Expression Vector and Development of an Efficient Transformation System for the Diatom Phaeodactylum tricornutum

作者
Wei-Hong Xie, Cong-Cong Zhu, Nai-Sheng Zhang, Da-Wei Li, Wei-Dong Yang, Jie-Sheng Liu, Ramalingam Sathishkumar, Hong-Ye Li
单位
Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institute, Jinan University; Plant Genetic Engineering Laboratory, Department of Biotechnology, Bharathiar University
杂志
Marine Biotechnology（2014）
DOI
10.1007/s10126-014-9570-3
所属领域
代谢工程
关键词
BioreactorDiatomMicroalgaePhaeodactylum tricornutumPlastid transformation
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解决的核心问题

缺乏硅藻质体（叶绿体）高效基因表达系统，无法利用质体作为亚细胞宿主生产重组蛋白。

研究策略

构建质体转化载体，将CAT筛选标记整合到质体基因组trnI-trnA转录活跃间隔区（IR区），通过电穿孔转化硅藻；进一步设计携带XcmI酶切位点的TA克隆载体pPtc-T，将eGFP报告基因克隆至PrbcL启动子和TrbcS终止子之间，评估表达水平。

研究路线图

100%
研究问题：缺乏硅藻质体高效基因表达系统
核心策略：构建质体转化载体，电穿孔导入硅藻
载体构建：pPtc-CAT（6192bp）
载体优化：pPtc-T（TA克隆载体，双XcmI位点）
基因重组：eGFP克隆至PrbcL-TrbcS间
关键改造：IR区trnI-trnA同源重组整合
关键改造：电穿孔转化法替代基因枪
结果1：转化效率5×10³/5×10⁶细胞，比核系统高100倍
结果2：eGFP表达量0.121%总蛋白，28kDa
结论：首个电穿孔硅藻质体表达系统，可用于工业蛋白质生产
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核心内容

该研究针对硅藻缺乏高效质体基因表达系统的问题，以模式硅藻三角褐指藻为对象，构建了新型质体转化载体并建立了便捷的遗传转化体系。研究者将氯霉素乙酰转移酶（CAT）筛选标记整合到质体基因组trnI-trnA转录活跃间隔区，利用电穿孔法替代昂贵的基因枪实现转化，并进一步设计携带双XcmI酶切位点的TA克隆载体pPtc-T，将eGFP报告基因置于PrbcL启动子和TrbcS终止子控制下评估表达。结果显示，质体转化效率约为每0.4 μg DNA在5×10⁶个细胞中获得5×10³个转化体，比核转化系统高100倍；eGFP表达量占总可溶蛋白的0.121%，且无需密码子优化即可实现较高表达，其转录水平比CAT高33.34倍。转化细胞可在300 mg/L氯霉素中正常生长，而野生型在200 mg/L即无法存活。该工作首次建立了基于电穿孔的硅藻质体转化系统，为利用质体作为亚细胞宿主生产重组蛋白提供了低成本、高效率的新工具，对硅藻质体功能研究和工业蛋白质生产具有重要推动作用。

创新点

首次在硅藻中建立基于电穿孔的质体转化系统，避免了昂贵的基因枪方法；利用IR区trnI-trnA间转录活跃间隔区作为整合位点，实现高效同源重组；设计了带双XcmI位点的TA克隆载体，简化外源基因克隆；无需密码子优化即可获得较高表达。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Phaeodactylum tricornutum 质体基因表达系统 CAT 氯霉素乙酰转移酶 催化 筛选标记，赋予氯霉素抗性，用于转化体筛选
Phaeodactylum tricornutum 质体基因表达系统 eGFP 增强型绿色荧光蛋白 催化 报告基因，自身催化荧光团形成，用于检测表达和亚细胞定位
Phaeodactylum tricornutum Rubisco基因调控 rbcL Rubisco大亚基（启动子PrbcL） 调控 强组成型启动子，驱动外源基因在质体中转录
Phaeodactylum tricornutum Rubisco基因调控 rbcS Rubisco小亚基（终止子TrbcS） 调控 终止子，用于终止转录并添加Myc标签

关键发现

  1. 质体转化效率约为每1000个微藻细胞产生1个转化克隆（5×10^3转化体/5×10^6细胞/0.4μg DNA），比核转化系统高100倍
  2. eGFP表达量占总可溶蛋白的0.121%
  3. eGFP转录水平比CAT高33.34倍
  4. eGFP蛋白分子量为28kDa
  5. 载体pPtc-CAT、pPtc-T、pPtc-eGFP大小分别为6192、6800、7417bp
  6. 转化细胞能在300mg/L氯霉素中生长，野生型在≥200mg/L氯霉素下不能存活。

研究结论

建立了首个方便高效的硅藻质体基因表达系统，通过电穿孔和同源重组实现外源基因稳定表达，为硅藻质体研究和工业蛋白质生产提供了新工具。