Structural diversity and functional novelty of new carotenoid biosynthesis genes
- 作者
- Qiong Cheng
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology（2006）
- DOI
- 10.1007/s10295-006-0121-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
新发现的类胡萝卜素生物合成基因在结构和功能上表现出多样性与新颖性，基于序列同源性的功能预测可能误导基因功能鉴定。
研究策略
综述近年通过基因组测序或功能克隆发现的类胡萝卜素合成新基因，结合系统发育分析探讨其进化起源，并通过异源表达、基因敲除和体外酶活实验验证功能。
研究路线图
核心内容
该研究系统综述了通过基因组测序和功能克隆发现的多种新型类胡萝卜素生物合成基因，并借助异源表达、基因敲除及体外酶活实验验证其功能，结合系统发育分析探讨进化起源。关键结果包括：鉴定出CrtYm与CrtLm为番茄红素β-单环化酶，其中CrtLm对神经孢烯活性高但对ζ-胡萝卜素无活性，且与其同源物氨基酸同源性仅31%；在嗜盐菌和硫化叶菌中发现融合型环化酶CrtYcd，其N端和C端分别与已知环化酶同源约29%；新型CruA环化酶在大肠杆菌中表达主要产生γ-胡萝卜素和少量β-胡萝卜素及torulene。此外，CrtO型酮醇酶与CrtW型无同源性，可在β-胡萝卜素上对称添加两个酮基生成角黄素；CrtNb作为新型C30类胡萝卜素氧化酶，经体外定向进化获得的突变体中四脱氢番茄红素二醛占总类胡萝卜素的85%。研究还揭示多顺式番茄红素异构酶CrtH/CrtISO、羟化酶CrtG及细胞色素P450型异构肾癌烯羟化酶的新功能。这些发现极大丰富了类胡萝卜素合成基因的结构与功能多样性，为基因工程合成新型类胡萝卜素提供了新元件，同时警示仅依赖序列同源性进行功能预测可能产生误导，部分同源物的真实功能仍需实验阐明。
创新点
总结了多种具有新结构或新功能的类胡萝卜素合成基因，如番茄红素β-单环化酶、融合型番茄红素β-环化酶、新型番茄红素β-环化酶、新型β-胡萝卜素酮醇酶、C30类胡萝卜素氧化酶、多顺式番茄红素异构酶、2,2′-β-紫罗酮环羟化酶和3,3′-异肾癌烯羟化酶等。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 海洋细菌P99-3（黄杆菌科） | 类胡萝卜素生物合成 | crtYm | CrtYm | 催化 | 番茄红素β-单环化酶，仅环化一端产生γ-胡萝卜素；在E. coli中功能验证 |
| Rhodococcus erythropholis AN12 | 类胡萝卜素生物合成 | crtLm | CrtLm | 催化 | 植物型番茄红素β-单环化酶，对CPTA敏感；还能作用于神经孢烯，对ζ-胡萝卜素无活性 |
| Deinococcus radiodurans R1 | 类胡萝卜素生物合成 | crtLm | CrtLm | 催化 | 与Rhodococcus CrtLm同源的番茄红素β-单环化酶，具有相似单环化功能 |
| Halobacterium salinarum | 类胡萝卜素生物合成 | crtYcd | CrtYcd | 催化 | 融合型番茄红素β-环化酶，N端与CrtYc同源，C端与CrtYd同源；缺失后积累番茄红素 |
| Sulfolobus solfataricus | 类胡萝卜素生物合成 | crtYcd | CrtYcd | 催化 | 另一种融合型番茄红素β-环化酶，在E. coli中异源表达验证功能 |
| Chlorobium tepidum | 类胡萝卜素生物合成 | cruA | CruA | 催化 | 新型番茄红素β-环化酶，在E. coli中表达主要产生γ-胡萝卜素和少量β-胡萝卜素、torulene |
| Synechocystis sp. PCC6803 | 类胡萝卜素生物合成 | crtO | CrtO | 催化 | 不对称作用的β-胡萝卜素酮醇酶，产生海胆酮；与CrtW型酮醇酶无同源性 |
| Rhodococcus sp. | 类胡萝卜素生物合成 | crtO | CrtO | 催化 | 对称作用的β-胡萝卜素酮醇酶，添加两个酮基生成角黄素；与CrtI有相似保守区域 |
| Deinococcus radiodurans | 类胡萝卜素生物合成 | crtO | CrtO | 催化 | 与Rhodococcus CrtO同源，同样对称添加两个酮基生成角黄素 |
| Methylomonas sp. 16a | C30类胡萝卜素生物合成 | crtNb | CrtNb | 催化 | 新型C30类胡萝卜素氧化酶，氧化4,4′-二氢番茄红素末端甲基生成醛基，而非脱饱和酶 |
| Staphylococcus aureus | C30类胡萝卜素生物合成 | crtNb | CrtNb | 催化 | 同源CrtNb氧化酶，与Methylomonas CrtNb有51%氨基酸同源性 |
| Synechocystis sp. PCC6803 | 类胡萝卜素生物合成 | crtH | CrtH | 催化 | 多顺式番茄红素异构酶，催化poly-cis番茄红素转化为全反式番茄红素 |
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 类胡萝卜素生物合成 | CrtISO | CRTISO | 催化 | 植物类番茄红素异构酶，功能与CrtH相同 |
| 番茄 (Lycopersicon esculentum) | 类胡萝卜素生物合成 | CrtISO | CRTISO | 催化 | tangerine突变体因CRTISO功能缺失积累poly-cis番茄红素 |
| Brevundimonas sp. SD212 | 类胡萝卜素生物合成 | crtG | CrtG | 催化 | 新型2,2′-β-紫罗酮环羟化酶，257个氨基酸，与甾醇C5脱饱和酶部分同源；对β-胡萝卜素无活性，需要含氧的β-紫罗酮环 |
| Brevibacterium linens | 类胡萝卜素生物合成 | orf10 | Orf10（细胞色素P450） | 催化 | 催化异肾癌烯的3,3′-羟基化，P450抑制剂和多突变体分析证实其功能 |
关键发现
- CrtYm与CrtLm均为番茄红素β-单环化酶，CrtLm对神经孢烯有较高活性而对ζ-胡萝卜素无活性
- CrtLm与其同源物（Rhodococcus和Deinococcus）间氨基酸同源性为31%，CrtLm对CPTA抑制剂敏感。融合型CrtYcd在H. salinarum和S. solfataricus中发现，其N端和C端分别与CrtYc和CrtYd同源，同源性约29%。新型CruA环化酶在C. tepidum中鉴定，在E. coli中表达主要产生γ-胡萝卜素、少量β-胡萝卜素和torulene。CrtO型β-胡萝卜素酮醇酶与CrtW型无显著同源性，Rhodococcus和Deinococcus CrtO对称性地在β-胡萝卜素上添加两个酮基产生角黄素
- CrtO氨基酸大小超过500，而CrtW约250。CrtNb为新型C30类胡萝卜素氧化酶，Methylomonas和Staphylococcus的CrtNb同源性为51%，CrtNb对4,4′-二氢番茄红素末端甲基氧化生成醛基
- 体外定向进化获得的一个突变体中2,4,2′,4′-四脱氢番茄红素二醛占总类胡萝卜素的85%。CrtH/CrtISO为多顺式番茄红素异构酶，在Synechocystis和植物中功能验证，其氨基酸同源性在蓝细菌与植物间为59-60%，植物间为85%。CrtG为2,2′-β-紫罗酮环羟化酶，由257个氨基酸组成，与已知蛋白无整体同源性，仅在中间区域与动物甾醇C5脱饱和酶部分同源，表达CrtG的E. coli积累玉米黄素、角黄素或虾青素时分别生成二羟基玉米黄素、二羟基角黄素或2-羟基虾青素，但对β-胡萝卜素无活性。B. linens的ORF10编码细胞色素P450型异构肾癌烯羟化酶，P450抑制剂四氯嘧啶处理后异构肾癌烯积累增加、羟基化产物减少。
研究结论
新发现的类胡萝卜素合成基因极大地丰富了该家族的多样性和功能新颖性，揭示了不同进化起源。这些基因可用于通过基因工程在天然或重组宿主中合成新型或理想的类胡萝卜素。同时，基于序列同源性的功能预测需谨慎，例如一些蓝细菌中的CrtU同源物并非合成芳香族类胡萝卜素的脱饱和酶，其真实功能尚待阐明。