Cloning and characterization of squalene synthase gene from Fusarium fujikuroi (Saw.) Wr.
- 作者
- Rui-Yu Zhao, Wei Xiao, Hai-Li Cheng, Ping Zhu, Ke-Di Cheng
- 单位
- Department of Biosynthesis of Natural Products, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College; Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products, Ministry of Health of PRC; Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization, Ministry of Education of PRC
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s10295-010-0764-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定藤仓赤霉（Fusarium fujikuroi）的角鲨烯合酶基因，解析其序列特征和酶活性，为调控异戊二烯代谢奠定基础。
研究策略
基于近源物种同源序列设计引物，通过PCR和基因组步移法克隆SQS基因；在E. coli中异源表达重组蛋白，利用GC-MS检测催化产物，并通过点突变验证关键氨基酸。
核心内容
本研究从藤仓赤霉（Fusarium fujikuroi）N920菌株中克隆并鉴定了角鲨烯合酶基因GfSQS。通过基于近源物种同源序列设计引物，结合PCR和基因组步移法获得全长基因，其基因组DNA长3267 bp，包含4个外显子和3个内含子；cDNA开放阅读框长1389 bp，编码462个氨基酸，预测分子量约53.4 kDa。研究发现该基因内含子存在非经典剪接位点（GC-AG），这一特征在真菌角鲨烯合酶中较为罕见。将GfSQS在E. coli BL21(DE3)中异源表达，重组蛋白最高产量达118 mg/L（13 h），经GC-MS检测证实野生型酶能将法尼基焦磷酸（FPP）催化转化为角鲨烯。通过点突变构建D82G突变体，该突变完全丧失催化活性，证实区域I中天冬氨酸富集基序（DTIED）为底物结合所必需。这是首次从藤仓赤霉中克隆并表征角鲨烯合酶基因，为后续通过调控该酶活性来操纵异戊二烯代谢通路、提高萜类化合物产量奠定了分子基础。
创新点
首次从藤仓赤霉中克隆并表征角鲨烯合酶基因；发现该基因内含子存在非经典剪接位点（GC-AG）；通过D82G突变证实区域I中天冬氨酸富集基序（DTIED）对酶活性必不可少。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium fujikuroi N920 | 甲羟戊酸途径/萜类生物合成 | GfSQS | 角鲨烯合酶（SQS） | 催化 | 基因来源，催化FPP生成角鲨烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达体系 | GfSQS | 重组角鲨烯合酶 | 催化 | 用于异源表达，野生型有活性，D82G突变体无活性 |
关键发现
- 克隆的GfSQS基因组DNA长3267 bp，含4个外显子和3个内含子
- cDNA开放阅读框长1389 bp，编码462个氨基酸，预测分子量53.4 kDa
- 重组蛋白在E. coli中最高产量为118 mg/L（13 h）
- 野生型GfSQS能催化FPP转化为角鲨烯，而D82G突变体完全丧失活性
- 发现非经典剪接位点CA-GG或GC-AG。
研究结论
本研究首次克隆并表征了藤仓赤霉的角鲨烯合酶基因，证实其编码功能性角鲨烯合酶，D82G突变完全失活，证明区域I中的天冬氨酸富集基序为底物结合所必需，并发现非经典内含子剪接方式，为调控该菌异戊二烯代谢流量提供了依据。