Improving ethanol productivity by modification of glycolytic redox factor generation in glycerol-3-phosphate dehydrogenase mutants of an industrial ethanol yeast
- 作者
- Zhong-peng Guo, Liang Zhang, Zhong-yang Ding, Zheng-Xiang Wang, Gui-Yang Shi
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s10295-010-0864-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
工业乙醇酵母中敲除GPD2导致NADH过剩，细胞生长受抑，如何通过调控糖酵解辅因子生成来缓解氧化还原失衡并提高乙醇产量。
研究策略
删除GPD2基因以减少甘油合成，同时异源表达来自蜡状芽孢杆菌的非磷酸化NADP+依赖甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPN）或来自乳酸克鲁维酵母的NADP+依赖甘油醛-3-磷酸脱氢酶（NADP+-GAPDH），将糖酵解中NADH生成替换为NADPH生成，平衡氧化还原状态。
核心内容
该研究针对工业乙醇酵母中敲除GPD2基因后NADH过剩导致生长受抑的问题，提出通过改造糖酵解辅因子生成来缓解氧化还原失衡。研究者利用cre-loxP系统在工业多倍体酵母GPD2缺失突变株中分别异源表达蜡状芽孢杆菌的非磷酸化NADP⁺依赖GAPN和乳酸克鲁维酵母的NADP⁺依赖GAPDH，将糖酵解中的NADH生成替换为NADPH生成。结果显示，仅敲除GPD2的菌株乙醇产量提高7.19%，甘油产量降低30.80%，但最大比生长速率降至0.19 h⁻¹；而表达GAPN和NADP⁺-GAPDH的重组菌AG2A和AG2B不仅甘油产量进一步降低至48.70%和52.90%，乙醇产量分别提高7.60%和7.34%，最大比生长速率也恢复至0.27和0.28 h⁻¹，接近野生型水平，葡萄糖消耗速率与野生型相当。此外，重组菌的乙酸和丙酮酸副产物产量也恢复至野生型水平。该策略通过引入NADP⁺依赖酶有效缓解NADH过剩的毒性，恢复生长并将碳流导向乙醇，为工业酵母的氧化还原工程提供了可行方案。
创新点
首次在工业多倍体乙醇酵母GPD2缺失突变株中分别过表达GAPN和NADP+-GAPDH；使用cre-loxP系统实现标记基因的反复利用，便于多基因工程操作。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CICIMY0086 (工业多倍体乙醇酵母) | 甘油合成 | GPD2 | NAD+依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 野生型中负责甘油合成的关键酶，被敲除以减少甘油生成 |
| Saccharomyces cerevisiae AG2A (gpd2Δ::P_PGK-gapN) | 糖酵解 | gapN | 非磷酸化NADP+依赖甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPN) | 催化 | 来自Bacillus cereus，异源表达以生成NADPH而非NADH，缓解氧化还原失衡 |
| Saccharomyces cerevisiae AG2B (gpd2Δ::P_PGK-GAPDH) | 糖酵解 | GAPDH | NADP+依赖甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (NADP+-GAPDH) | 催化 | 来自Kluyveromyces lactis，异源表达以替代内源NAD+依赖酶，减少NADH生成 |
关键发现
敲除GPD2的AG2菌株乙醇产量提高7.19±0.21%，甘油产量降低30.80±0.52%，但最大比生长速率降至0.19 h^-1。重组菌AG2A（表达GAPN）和AG2B（表达NADP+-GAPDH）的甘油产量分别降低48.70±0.34%和52.90±0.45%，乙醇产量分别提高7.60±0.12%和7.34±0.15%，最大比生长速率分别恢复至0.27±0.01和0.28±0.01 h^-1，接近野生型0.29±0.02 h^-1。AG2A和AG2B的葡萄糖消耗速率分别为1.67±0.13和1.72±0.21 g/h，与野生型1.72±0.18 g/h相当。AG2A的GAPN活性为4.15 U/mg protein，AG2B的NADP+-GAPDH活性为3.05 U/mg protein，野生型无可检测活性。另外，AG2的乙酸和丙酮酸产量分别下降24.8%和41.5%，而AG2A和AG2B的这些副产物产量与野生型基本一致。
研究结论
通过在GPD2缺失突变株中表达NADP+依赖的GAPN或NADP+-GAPDH，可以有效缓解NADH过剩带来的毒性作用，恢复生长并减少甘油合成，同时将碳流导向乙醇，显著提高工业乙醇酵母的乙醇产量，该组合策略是提升乙醇产量的有效途径。