Improvement of NADPH bioavailability in Escherichia coli by replacing NAD+-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GapA with NADP+-dependent GapB from Bacillus subtilis and addition of NAD kinase
- 作者
- Yipeng Wang, Ka-Yiu San, George N. Bennett
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s10295-013-1335-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中NADPH生物可利用性不足，限制了NADPH依赖型化合物的生物合成效率
研究策略
将大肠杆菌内源NAD+依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GapA）替换为枯草芽孢杆菌的NADP+依赖型GapB，并共表达NAD激酶（NadK）以增加NADP+供应，从而构建NADPH生成的糖酵解途径
核心内容
该研究针对大肠杆菌中NADPH生物可利用性不足、限制NADPH依赖型产物合成效率的问题，提出将内源NAD+依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶GapA替换为枯草芽孢杆菌的NADP+依赖型GapB，并共表达NAD激酶NadK以增加NADP+供应，从而构建NADPH再生型糖酵解途径。作者以三种NADPH依赖型报告系统（CHMO、番茄红素、CAA43）验证策略效果。结果表明，在CHMO报告中，替换GapA为GapB后ε-己内酯产量在2小时内从3.3 mM/葡萄糖mM提升至5.7 mM/葡萄糖mM，约1.7倍；番茄红素报告中gapB过表达菌株产量达2042 μg/g DCW，而野生型仅为1061 μg/g DCW；CAA43报告中gapB与nadK共表达使产物产量提高119%，且用于NADPH依赖产物的还原当量比例从野生型的30%提高至49%。该策略显著提升了大肠杆菌内NADPH的生物可利用性，为其他细菌体系中NADPH依赖型产物的高效合成提供了可行方案。
创新点
1. 首次在大肠杆菌中利用枯草芽孢杆菌的NADP+依赖型GapB构建NADPH生成型糖酵解途径；2. 与NAD激酶共表达以解除NADP+供应限制；3. 采用三个独立报告系统（CHMO、番茄红素、CAA43）全面验证NADPH生物可利用性的提升效果
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | 糖酵解 | gapA | GapA | 催化 | 内源NAD+依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，在本研究中被替换 |
| Escherichia coli MG1655 | 糖酵解 | gapB | GapB | 催化 | 来自枯草芽孢杆菌的NADP+依赖型GAPDH，用于替代GapA，生成NADPH |
| Escherichia coli MG1655 | 辅因子合成 | nadK | NadK | 催化 | NAD激酶，将NAD+磷酸化为NADP+，提高NADP+供应 |
| Escherichia coli MG1655 | 番茄红素生物合成（MEP途径） | crtE, crtI, crtB | CrtE, CrtI, CrtB | 催化 | 来自革兰氏阴性菌Erwinia herbicola，用于合成番茄红素，消耗NADPH |
| Escherichia coli MG1655 | Baeyer-Villiger氧化 | chnB (CHMO) | CHMO | 催化 | 来自Acinetobacter sp. NCIB 9871的环己酮单加氧酶，将环己酮氧化为ε-己内酯，依赖NADPH |
| Escherichia coli MG1655 | 2-卤代丙烯酸还原 | CAA43 | CAA43 | 催化 | 来自Burkholderia sp. WS的2-卤代丙烯酸还原酶，将2-氯丙烯酸还原为2-氯丙酸，依赖NADPH |
关键发现
- 在CHMO报告中，替换GapA为GapB后，2小时内ε-己内酯产量从3.3 mM/葡萄糖mM提高到5.7 mM/葡萄糖mM（约1.7倍）。在番茄红素报告中，24小时gapB过表达菌株产量为134 μg/mmol葡萄糖，对照为42 μg/mmol葡萄糖
- 按干重计，gapB过表达菌株为2042 μg/g DCW，nadK过表达菌株为1386 μg/g DCW，gapB+nadK双表达菌株为1110 μg/g DCW，野生型为1061 μg/g DCW。在CAA43报告中，与野生型相比，gapB过表达菌株产物产量提高21%，nadK过表达提高73%，gapB+nadK共表达提高119%
- 共表达菌株中用于NADPH依赖产物的还原当量比例从野生型的30%提高到49%。
研究结论
将糖酵解中NADH生成酶替换为NADPH生成酶并共表达NAD激酶，可显著提高大肠杆菌内NADPH生物可利用性，有效促进NADPH依赖型产物的生物合成，该策略可推广至其他细菌生产体系。