In silico aided metabolic engineering of Klebsiella oxytoca and fermentation optimization for enhanced 2,3-butanediol production
- 作者
- Jong Myoung Park, Hyohak Song, Hee Jong Lee, Doyoung Seung
- DOI
- 10.1007/s10295-013-1298-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过基因敲除减少副产物并优化发酵工艺，提高Klebsiella oxytoca生产2,3-丁二醇的产量、产率和生产率。
研究策略
基于基因组尺度代谢模型KoxGSC1457进行in silico基因敲除模拟，选择ldhA和pflB双敲除菌株，并通过两阶段搅拌转速控制（450转350 rpm）进行补料分批发酵。
核心内容
该研究利用基因组尺度代谢模型KoxGSC1457对产酸克雷伯氏菌进行模拟基因敲除，筛选出同时敲除ldhA和pflB的双突变株，以消除乳酸和甲酸等副产物积累且不破坏胞内氧化还原平衡。补料分批发酵中，该菌株2,3-丁二醇浓度达40.89 g/L，产量0.44 g/g，约为理论最大值的90%。进一步发现搅拌转速对细胞生长与产物合成影响显著，恒定450 rpm虽将生产率提升至1.65 g/L/h，但产量下降至0.29 g/g。为此提出以acetoin约10 g/L为切换判据的两阶段搅拌转速策略（450转350 rpm），最终2,3-丁二醇浓度达113 g/L，产量0.45 g/g，生产率2.1 g/L/h，较恒定450 rpm分别提高95.2%、55.2%和27.3%，同时乳酸和甲酸分别降至3.38 g/L和0.80 g/L。结果表明，将计算机模拟菌株设计与发酵过程动态调控相结合，可同步实现高浓度、高产量与高生产率的2,3-丁二醇生产，为工业化应用提供了可行方案。
创新点
1) 利用in silico基因组尺度模型指导基因敲除，同时敲除ldhA和pflB以消除多种副产物且不破坏氧化还原平衡；2) 揭示搅拌转速对细胞生长及2,3-BD合成的影响，提出以acetoin浓度作为切换判据的两阶段搅拌转速策略，同时实现高浓度、高产量和高生产率。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella oxytoca | 乳酸合成 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 编码乳酸脱氢酶，敲除后可消除乳酸副产物，增加2,3-BD前体丙酮酸 |
| Klebsiella oxytoca | 丙酮酸代谢 | pflB | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 催化丙酮酸生成乙酰辅酶A和甲酸，敲除后减少甲酸和乙醇生成 |
| Klebsiella oxytoca | 中心碳代谢 | — | 丙酮酸脱氢酶复合体（PDC） | 催化 | 在有氧条件下将丙酮酸转化为乙酰辅酶A，可补偿pflB失活导致的乙酰辅酶A不足 |
关键发现
- 敲除ldhA和pflB后，2,3-BD浓度达40.89 g/L（野生型17.31 g/L，ΔldhA为29.91 g/L），产量0.44 g/g（约为理论最大产量的90%），但生产率降至0.51 g/L/h
- 通过将搅拌转速从150提高至450 rpm，2,3-BD生产率从0.43 g/L/h提高至2.7 g/L/h，但产量从0.44降至0.35 g/g，浓度从38.55降至30.79 g/L
- 恒定450 rpm的补料分批发酵获得57.7 g/L 2,3-BD，产量0.29 g/g，生产率1.65 g/L/h
- 采用两阶段搅拌转速（450转350 rpm，在acetoin约10 g/L时切换），最终2,3-BD达113 g/L，产量0.45 g/g，生产率2.1 g/L/h，分别比恒定450 rpm提高95.2%、55.2%和27.3%
- 同时，乳酸产量从野生型的32.2 g/L降至3.38 g/L，甲酸降至0.80 g/L。
研究结论
通过系统代谢工程与发酵过程优化，K. oxytoca ΔldhA ΔpflB菌株在补料分批发酵中达到113 g/L 2,3-BD、0.45 g/g产率和2.1 g/L/h生产率，展示了该方法对提高2,3-BD生产效率的有效性，并具备工业应用潜力。