Use of an EZ-Tn5-based random mutagenesis system to create a Zymomonas mobilis with significant tolerance to heat stress and malnutrition
- 作者
- Xianghui Jia, Na Wei, Tianyv Wang, Haoyong Wang
- 单位
- Key Laboratory of Fermentation Engineering (Ministry of Education), Hubei University of Technology; Research and Teaching Center, Wuhan Yangtze Business University; Nanhu Middle School
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s10295-013-1287-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Zymomonas mobilis在高温和营养缺乏条件下生长差、乙醇产率低，影响工业发酵经济性。
研究策略
利用EZ-Tn5转座系统将E. coli的yfdZ和metB基因以及P. furiosus的Pfu-sHSP基因整合入Z. mobilis CP4基因组，构建同时耐热和耐低营养的重组菌HYM；并通过Box-Behnken设计优化发酵条件。
核心内容
该研究利用EZ-Tn5转座系统，将大肠杆菌的yfdZ和metB基因及激烈火球菌的Pfu-sHSP小热激蛋白基因整合至运动发酵单胞菌CP4基因组，构建出同时耐受高温和营养缺乏的重组菌株HYM。yfdZ和metB分别补全了赖氨酸与甲硫氨酸合成途径，使HYM可在无氨基酸的简单化学限定培养基中正常生长；Pfu-sHSP则增强了菌株的耐热性。在230 g/L葡萄糖、32°C发酵60小时条件下，HYM乙醇浓度达87.1 g/L，高于野生型CP4的78.4 g/L，产率提高11%；42°C时HYM乙醇产率为0.19 g/g，显著高于CP4的0.12 g/g。通过Box-Behnken响应面法优化发酵条件（温度28.1°C、葡萄糖241 g/L、初始pH 7.4），预测最大乙醇产量104.5 g/L，六次验证实验平均值为105.1 g/L，理论产率达85.6%。该菌株在非选择培养基传代100代后遗传特性稳定。研究证明多基因整合策略可有效提升运动发酵单胞菌在高温和营养受限条件下的乙醇生产效率，为工业发酵提供了具有应用潜力的菌株。
创新点
首次利用EZ-Tn5随机突变系统将多基因整合至Z. mobilis基因组；首次证明Pfu-sHSP能提高Z. mobilis耐热性；通过补全赖氨酸/甲硫氨酸合成基因使菌株能在无氨基酸的简单培养基生长；结合响应面法优化。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Zymomonas mobilis CP4 | 赖氨酸生物合成 | yfdZ | YfdZ (PLP-dependent aminotransferase) | 催化 | 来自E. coli K12，补全Z. mobilis缺失的赖氨酸合成关键酶 |
| Zymomonas mobilis CP4 | 甲硫氨酸生物合成 | metB | MetB (PLP-dependent cystathionine gamma-synthase) | 催化 | 来自E. coli K12，补全Z. mobilis缺失的甲硫氨酸合成关键酶 |
| Zymomonas mobilis CP4 | 热应激响应/蛋白质稳态 | Pfu-sHSP | Pfu-sHSP (small heat shock protein) | 调控 | 来自Pyrococcus furiosus，分子伴侣，防止热应激下蛋白聚集 |
关键发现
- 构建的HYM菌株在无氨基酸简单化学限定培养基中可正常生长（32°C和42°C）；在230 g/L葡萄糖、32°C、60 h发酵下，HYM乙醇浓度87.1 g/L，高于CP4的78.4 g/L，乙醇产率0.38 vs
- 34 g/g，提高11%；42°C时HYM乙醇产率0.19 g/g，显著高于CP4的0.12 g/g；整合三基因使乙醇产量比原始菌株提高9%；经BBD优化（温度28.1°C、葡萄糖241 g/L、初始pH
- 4），预测最大乙醇104.5 g/L，六次验证实验平均值为105.1 g/L，比优化前提高6.5%，理论产率85.6%；遗传特性在非选择培养基传代100代后稳定。
研究结论
重组菌HYM具备显著的耐热和耐低营养能力，且乙醇产量高、遗传稳定，是经济高效的乙醇生产菌株，可用于高温和营养受限条件下的工业发酵。