高级醇 · 代谢工程文献库

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Characterization of Clostridium thermocellum strains with disrupted fermentation end-product pathways

作者
Douwe van der Veen, Jonathan Lo, Steven D. Brown, Courtney M. Johnson, Timothy J. Tschaplinski, Madhavi Martin, Nancy L. Engle, Robert A. van den Berg, Aaron D. Argyros, Nicky C. Caiazza, Adam M. Guss, Lee R. Lynd
单位
Thayer School of Engineering, Dartmouth College; BioEnergy Science Center; Department of Biological Sciences, Dartmouth College; Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory; Research Group on Quantitative Psychology, Katholieke Universiteit Leuven; Mascoma Corporation
杂志
Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology（2013）
DOI
10.1007/s10295-013-1275-5
所属领域
代谢工程
关键词
Clostridium thermocellum乙醇发酵乳酸脱氢酶氧化还原平衡氨基酸分泌磷酸转乙酰酶
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解决的核心问题

理解在Clostridium thermocellum中破坏乳酸和乙酸生成途径后，碳流和电子流如何重新分配，以及为何乙醇产量未能如预期显著提高。

研究策略

构建ldh、pta基因敲除及双敲除进化菌株，在纤维二糖为唯一碳源的限定培养基中进行生物反应器发酵，比较其生长特性、发酵终产物、胞内代谢物和胞外氨基酸分泌，并结合酶活测定和GC-MS代谢组学分析。

研究路线图

100%
研究问题：C. thermocellum终产物途径破坏后碳流与电子流再分配机制
策略：构建ldh/pta敲除菌株，限定培养基纤维二糖发酵
关键改造：Δpta菌株乙醇产量提升75%（17 mM vs 11 mM）
研究对象基因：spo0A（Cthe_0812）芽孢调控
研究对象基因：hpt 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶
结果：胞内丙酮酸积累6-16倍，NADPH过剩触发氨基酸分泌
结论：氨基酸分泌回收NADP+，碳流分流导致乙醇产率受限
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核心内容

本研究系统表征了热纤梭菌DSM1313中乳酸脱氢酶(ldh)和磷酸转乙酰酶(pta)基因敲除及其进化双敲除菌株的生理特性。在纤维二糖限定培养基的生物反应器发酵中，Δpta菌株乙醇产量达17 mM，较亲本株的约11 mM提高75%（理论产率从19%升至29%），但最终生物量降低30%。进化ΔldhΔpta菌株乙醇产量与亲本相当，生物量积累与Δpta类似。胞内代谢物分析显示，Δpta和进化ΔldhΔpta菌株的丙酮酸分别升高6倍和16倍，而葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸水平降低3-6倍。所有菌株均分泌游离氨基酸，其中Δpta和进化ΔldhΔpta菌株大量分泌丙氨酸、缬氨酸等，进化双敲除菌株发酵结束时缬氨酸浓度达5 mM，占底物碳的2.7%。研究表明，途径敲除导致胞内丙酮酸积累和NADPH过剩，细胞通过合成并分泌氨基酸再生NADP+，将碳流从乙醇生产分流至氨基酸合成。这解释了为何传统途径敲除策略难以显著提高热纤梭菌乙醇产量，为后续代谢工程改造提供了重要靶点和理论依据。

创新点

首次对C. thermocellum的Δpta和进化ΔldhΔpta菌株进行系统的生理学表征；发现pta破坏使乙醇产量提高75%；揭示氨基酸分泌作为NADP+再生的潜在机制；阐明胞内丙酮酸积累与氨基酸分泌的相关性。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Clostridium thermocellum DSM1313 乳酸发酵 ldh (Cthe_1053) L-乳酸脱氢酶 催化 敲除ldh后仍有少量L-乳酸产生，可能由苹果酸脱氢酶（Cthe_0345）等互补酶催化。
Clostridium thermocellum DSM1313 乙酸发酵 pta (Cthe_1029) 磷酸转乙酰酶 催化 敲除pta后乙酸产量降至亲本水平的8%左右（0.5-0.7 mM），乙醇产量提高75%。
Clostridium thermocellum DSM1313 芽孢形成调控 spo0A (Cthe_0812) Spo0A 调控 在亲本背景中删除spo0A以消除芽孢形成，所有突变菌株均基于此背景。
Clostridium thermocellum DSM1313 嘌呤补救途径 hpt 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 催化 用于遗传筛选的背景基因敲除，产生Δhpt菌株。

关键发现

  1. Δpta菌株乙醇产量达17 mM，比亲本和其他菌株的约11 mM高75%（分别对应理论产率的29%和19%）
  2. Δpta菌株最终生物量浓度比亲本低30%（0.7 g/L对1.0 g/L CDW）
  3. 进化ΔldhΔpta菌株乙醇产量与亲本相当（11.5 mM对9.7 mM），但生物量积累与Δpta类似
  4. 所有菌株均分泌游离氨基酸，Δpta和进化ΔldhΔpta菌株分泌更多的丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸
  5. 进化ΔldhΔpta菌株发酵结束时缬氨酸浓度达5 mM，占底物碳的2.7%（最大OD时缬氨酸达5,077 μM，占初始碳的14.2%）
  6. 胞内丙酮酸浓度在Δpta中升高6倍，在进化ΔldhΔpta中升高16倍
  7. pta破坏菌株中葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸水平比亲本低3-6倍。

研究结论

破坏发酵终产物途径导致胞内丙酮酸积累和NADPH过剩，细胞通过合成并分泌氨基酸来再生NADP+，从而将碳流从乙醇生产分流至氨基酸合成，这是C. thermocellum乙醇产量难以通过传统途径敲除策略显著提高的重要原因。