Improvement of oxidative stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae through global transcription machinery engineering
- 作者
- Hongwei Zhao, Jingyuan Li, Beizhong Han, Xuan Li, Jingyu Chen
- 单位
- College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing, China; Laboratory of Renewable Resources Engineering, Purdue University, West Lafayette, IN, USA; Department of Agricultural and Biological Engineering, Purdue University, West Lafayette, IN, USA; College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao, China
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s10295-014-1421-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
发酵过程中氧化胁迫严重损害酵母细胞，影响发酵效率和产品质量，需要提高酿酒酵母对过氧化氢（H2O2）引起的氧化胁迫的耐受性。
研究策略
采用全局转录机器工程（gTME），对转录因子SPT15和TAF25进行易错PCR随机突变，构建质粒突变文库并转化至酿酒酵母BY4741，通过H2O2梯度筛选获得氧化胁迫耐受性显著提高的突变株。
核心内容
该研究通过全局转录机器工程（gTME）策略，对酿酒酵母BY4741的转录因子SPT15和TAF25进行易错PCR随机突变，构建突变文库并经H2O2梯度筛选，获得了氧化胁迫耐受性显著提升的突变株spt15-5和taf25-3。在2.5 mM H2O2胁迫下，两突变株生长量较对照提高约10倍，其中taf25-3在3.0 mM H2O2时OD600最大提升13.76倍；休克实验中2.0 mM H2O2处理2小时后存活率约为对照的100倍。突变株胞内ROS水平显著低于对照，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性均明显升高。发酵实验中，taf25-3较对照提前12小时进入对数期，72小时乙醇浓度达44.45 g/L（对照36.65 g/L），体积产率提高25.5%。结果表明，通过随机突变一般转录因子引入氨基酸替换，可有效重塑酵母的氧化防御系统，为提升工业发酵效率提供了可行途径。
创新点
首次将gTME应用于开发氧化耐受酵母菌株；通过随机突变转录因子SPT15和TAF25，获得在中等H2O2浓度下生长大幅提升的突变株；揭示了转录因子氨基酸替换可重塑细胞氧化防御系统。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 BY4741 | 氧化应激防御 | SPT15 | TATA结合蛋白（Tbp） | 调控 | 突变产生截短蛋白，含5个氨基酸替换（S136R, K138I, R141G, G147R, K167N），提高氧化耐受性 |
| 酿酒酵母 BY4741 | 氧化应激防御 | TAF25 | Taf(II)25 (Taf25) | 调控 | TFIID复合体组分，含6个氨基酸替换（D106Y, R108Q, Q158R, P160T, K180I, L188P），提高氧化耐受性和发酵性能 |
关键发现
- 分离出spt15-5和taf25-3两个突变株。在2.5 mM H2O2下，两突变株比对照C1/C2生长提高约10倍
- 在2.0–3.5 mM H2O2范围内，spt15-5和taf25-3的OD600最大分别提高11.2倍（2.5 mM）和13.76倍（3.0 mM）。休克实验中，2.0 mM H2O2处理2 h后突变株存活约100倍于对照，6.0 mM时约10倍。细胞内ROS水平：对照C3比spt15-5和taf25-3分别高52.86%和89.36%。在2.0 mM H2O2胁迫下，spt15-5和taf25-3的CAT活性分别为7.67和6.84 U/mg prot，对照C3为4.97
- SOD活性分别为128.24和155.36 U/mg prot，对照为92.65。发酵实验中，taf25-3比对照C3提前12小时进入对数期，72 h时乙醇浓度达44.45 g/L（对照36.65 g/L），乙醇体积产率提高25.5%
- 葡萄糖消耗速率分别为1.76和1.35 g/(L·h)。
研究结论
通过gTME对一般转录因子Spt15和Taf25进行氨基酸替换，可有效改变酿酒酵母的氧化防御系统，提高其对H2O2诱导氧化胁迫的耐受性和发酵效率，有望使工业乙醇发酵更高效、经济。