Cloning, expression and characterization of glycerol dehydrogenase involved in 2,3-butanediol formation in Serratia marcescens H30
- 作者
- Liaoyuan Zhang, Quanming Xu, Xiaoqian Peng, Boheng Xu, Yuehao Wu, Yulong Yang, Shujing Sun, Kaihui Hu, Yaling Shen
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s10295-014-1472-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在粘质沙雷氏菌H30中，meso-2,3-丁二醇脱氢酶（budC编码）的失活并未完全消除2,3-丁二醇的生成，说明存在其他类似酶参与该过程。本研究旨在鉴定并表征参与2,3-丁二醇形成的甘油脱氢酶（GDH），以解释这一现象。
研究策略
从S. marcescens H30基因组中克隆gldA基因，在E. coli BL21(DE3)中异源表达，通过亲和层析纯化重组GDH，测定其底物特异性、动力学参数、pH/温度依赖性、金属离子影响，并利用手性气相色谱分析其立体化学特性。
核心内容
该研究从粘质沙雷氏菌H30中克隆了gldA基因，其开放阅读框长1101 bp，编码366个氨基酸，与Db11菌株同源性达95%。重组甘油脱氢酶在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达并经亲和层析纯化，比活力由粗酶液的10.48 U/mg提升至20.75 U/mg。酶学表征显示，该酶最适pH为8.0（还原乙酰乳酸和氧化meso-2,3-丁二醇）或7.0（还原丁二酮），最适温度60°C。底物特异性方面，氧化甘油相对活性为146%，对meso-2,3-丁二醇为100%，对(2R,3R)-2,3-丁二醇仅为9%，(2S,3S)-2,3-丁二醇完全无活性；还原反应中以(3S/3R)-乙酰乳酸活性最高。动力学参数显示，对(3S/3R)-乙酰乳酸的催化效率最高，达9.62 s⁻¹ mM⁻¹。金属离子调控显著：Fe²⁺使meso-2,3-丁二醇氧化活性增强至784%，而Fe²⁺和Fe³⁺强烈抑制乙酰乳酸还原（活性低于15%）。立体化学分析表明，该酶氧化meso-2,3-丁二醇仅生成(3S)-乙酰乳酸，氧化(2R,3R)-2,3-丁二醇仅生成(3R)-乙酰乳酸。这些结果证实GDH在甘油代谢和2,3-丁二醇形成中具有双重功能，其立体选择性和金属离子响应特性为定向生产单一构型(3S)-乙酰乳酸和meso-2,3-丁二醇提供了酶学基础。
创新点
首次发现并证实S. marcescens H30中的GDH（gldA编码）在甘油代谢和2,3-丁二醇形成中具有双重作用；揭示了该酶对底物的立体选择性（选择性氧化meso-2,3-BD的R-碳和(2R,3R)-2,3-BD）；提出利用金属离子调节实现(3S)-乙酰乳酸和meso-2,3-丁二醇单一构型生产的潜在策略。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 2,3-丁二醇生物合成 | gldA | 甘油脱氢酶 (GDH) | 催化 | 异源表达宿主，使用pET28a-gldA重组质粒，纯化后比活力20.75 U/mg |
| Serratia marcescens H30 | 2,3-丁二醇生物合成 | gldA | 甘油脱氢酶 (GDH) | 催化 | 来源菌株，gldA参与2,3-BD形成，与budC失活后残余2,3-BD产生相关 |
关键发现
- gldA基因ORF长1101 bp，编码366个氨基酸，与S. marcescens Db11同源性95%（氨基酸97%）。粗酶液比活力10.48 U/mg，纯化后为20.75 U/mg，纯化倍数1.98。最适pH：还原(3S/3R)-乙酰乳酸和氧化meso-2,3-丁二醇及甘油为pH
- 0，还原丁二酮为pH
- 0。最适温度60°C，70°C时保留>60%活性。底物特异性：氧化反应中甘油相对活性146%，meso-2,3-BD 100%，(2R,3R)-2,3-BD 9%，(2S,3S)-2,3-BD无活性；还原反应中(3S/3R)-乙酰乳酸100%，丁二酮72%，甲醛3%。动力学参数：甘油Km=7.76 mM，kcat=10.12 s^-1；meso-2,3-BD Km=22.58 mM，kcat=11.85 s^-1；(2R,3R)-2,3-BD Km=154.22 mM，kcat=2.23 s^-1；(3S/3R)-乙酰乳酸Km=3.14 mM，kcat=30.21 s^-1；丁二酮Km=8.02 mM，kcat=20.17 s^-1。催化效率(kcat/Km)以(3S/3R)-乙酰乳酸最高为9.62 s^-1 mM^-1，丁二酮为2.52。金属离子：Fe2+使meso-2,3-BD氧化活性增强至784%，Fe2+和Fe3+强烈抑制(3S/3R)-乙酰乳酸还原（<15%活性），Mn2+等使(3S/3R)-乙酰乳酸还原活性增强9-86%。立体特异性：meso-2,3-BD氧化仅生成(3S)-乙酰乳酸；(2R,3R)-2,3-BD氧化仅生成(3R)-乙酰乳酸；丁二酮还原生成(3S)-乙酰乳酸和meso-2,3-BD；(3S/3R)-乙酰乳酸还原生成meso-2,3-BD和(2R,3R)-2,3-BD，(2S,3S)-2,3-BD不是底物。
研究结论
S. marcescens H30的甘油脱氢酶GDH（gldA编码）在甘油代谢和2,3-丁二醇形成中发挥双重作用，其立体选择性和独特的金属离子响应特性为通过酶催化或全细胞催化实现单一构型(3S)-乙酰乳酸和meso-2,3-丁二醇的生产提供了潜在应用价值。