Increased valinomycin production in mutants of Streptomyces sp. M10 defective in bafilomycin biosynthesis and branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex expression
- 作者
- Dong Wan Lee, Bee Gek Ng, Beom Seok Kim
- 单位
- Department of Biosystems and Biotechnology, Korea University Graduate School, Seoul, Republic of Korea; Division of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, Seoul, Republic of Korea
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s10295-015-1679-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Streptomyces sp. M10产生的抗真菌活性物质缬氨霉素（valinomycin）产量低，同时产生bafilomycin衍生物与该活性成分竞争共同前体，需要提高缬氨霉素产量以增强生物农药效力。
研究策略
克隆bafilomycin生物合成基因簇和两个BCDH基因簇，通过PCR靶向基因替换构建bafV、bkdF、bkdA、bkdR等基因敲除突变体，阻断或调节竞争途径，重新分配前体代谢流，并通过前体饲喂实验验证。
核心内容
针对Streptomyces sp. M10缬氨霉素产量低且与bafilomycin竞争共同前体的问题，研究者通过PCR靶向基因替换构建了一系列基因敲除突变体。结果显示，敲除bafilomycin合成基因bafV使缬氨霉素产量提高1.2至1.5倍；敲除BCDH复合物E1α亚基基因bkdF则使bafilomycin完全消失，缬氨霉素产量提升4倍至16.0 mg/L，同时发现bkdR是该BCDH基因簇的转录抑制因子，其缺失使bafilomycin B产量提高2.4倍。前体饲喂实验证实两种化合物共享缬氨酸/2-酮异戊酸前体，且M10bkdFm株补充异丁酸后恢复bafilomycin产生，补充缬氨酸后缬氨霉素产量达11.7至22.1 mg/L。该工作首次在M10菌株中通过敲除bkdF实现目标产物4倍增产，证明阻断竞争性支链氨基酸分解代谢以重新分配前体通量，是提高生物农药活性成分产量的有效策略。
创新点
首次在Streptomyces sp. M10中通过敲除bkdF（BCDH复合物E1α亚基）实现valinomycin产量4倍提升；揭示bkdR为BCDH基因簇的转录抑制因子，其缺失使bafilomycin B产量提高2.4倍；证明通过阻断竞争性支链氨基酸分解代谢可增强目标活性成分产量。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces sp. M10 | bafilomycin生物合成 | bafV | bafilomycin聚酮合酶亚基（含硫酯酶结构域） | 催化 | 敲除后bafilomycin不再产生，valinomycin产量提高1.2-1.5倍 |
| Streptomyces sp. M10 | 支链氨基酸分解代谢/BCDH | bkdF | BCDH复合体E1α亚基 | 催化 | 敲除后bafilomycin完全消失，valinomycin产量提高4倍（16.0 mg/L） |
| Streptomyces sp. M10 | 支链氨基酸分解代谢/BCDH | bkdA | BCDH复合体E1α亚基（第一簇） | 催化 | 敲除后对抗生素产量无显著影响 |
| Streptomyces sp. M10 | BCDH基因簇调控 | bkdR | Lrp家族转录调控因子 | 调控 | 负调控bkdF转录，敲除使bafilomycin B产量提高2.4倍 |
| Streptomyces sp. M10 | bafilomycin生物合成 | bafI-bafV | bafilomycin PKS | 催化 | 五个ORF组成的基因簇，与S. griseus和S. lohii同源 |
| Streptomyces sp. M10 | valinomycin生物合成 | — | valinomycin NRPS | 催化 | 与bafilomycin共享前体2-酮异戊酸 |
关键发现
- 敲除bafV（M10bafm）使bafilomycin不再产生，valinomycin产量提高1.2-1.5倍（4.8-6.0 mg/L）
- 敲除bkdF（M10bkdFm）使bafilomycin完全消失，valinomycin产量提高4倍（16.0 mg/L）
- 敲除bkdR使bafilomycin B产量提高2.4倍。前体饲喂实验中，40-80 mM L-缬氨酸使野生型bafilomycin产量提高约2.0倍，10-20 mM L-缬氨酸使valinomycin产量提高
- 20 mM L-异亮氨酸使bafilomycin从16.6 mg/L提高到26.7 mg/L（约1.6倍）
- 5 mM异丁酸使bafilomycin产量提高约1.8倍
- M10bkdFm株补充异丁酸后恢复bafilomycin产生约6.8 mg/L，补充缬氨酸后valinomycin产量达11.7-22.1 mg/L。
研究结论
在Streptomyces sp. M10中，bafilomycin生物合成与valinomycin生物合成共享缬氨酸/2-酮异戊酸前体。通过敲除bafilomycin生物合成基因或BCDH复合物关键基因bkdF，可阻断前体流向bafilomycin，使valinomycin产量显著提升（最高4倍，16.0 mg/L），同时保留抗真菌活性。这表明通过代谢工程重新分配前体通量是提高生物农药活性成分产量的有效策略。