Lactobacillus casei as a biocatalyst for biofuel production
- 作者
- Elena Vinay-Lara, Song Wang, Lina Bai, Ekkarat Phrommao, Jeff R. Broadbent, James L. Steele
- 单位
- Department of Food Science, University of Wisconsin- Madison; College of Food Science, Northeast Agricultural University; College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University; Department of Nutrition, Dietetics, and Food Sciences, Utah State University
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s10295-016-1797-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
微生物发酵生产醇类燃料时，产物乙醇/异丁醇及木质纤维素水解液中的抑制剂（如酚类、乙酸、高渗糖）对底盘细胞具有毒性，导致产量低，亟需筛选和构建具有高固有酒精耐受性、能利用混合糖并耐受多种胁迫的工业生物催化剂。
研究策略
系统评估5株Lactobacillus casei对乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇和2-甲基-1-丁醇的耐受性；选择综合性能最好的L. casei 12A，通过敲除ldh1并整合来源于Zymomonas mobilis的PET cassette（编码PDC和ADHII，由pgm启动子驱动），构建乙醇工程菌L. casei E1；在模拟玉米秸秆水解液（mSynH）中与E. coli GLBRC E1和Z. mobilis ATCC 31821比较生长速率、酒精耐受性、胁迫抗性和乙醇产量。
核心内容
该研究系统评估了5株干酪乳杆菌对乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇及2-甲基-1-丁醇的耐受性，其中UW-1对乙醇生长的半数抑制浓度最高（7%），12A的细胞密度耐受上限达9.21%乙醇。选择综合性能最佳的12A菌株，敲除其ldh1基因并整合运动发酵单胞菌的PET cassette（由pgm启动子驱动表达PDC和ADHII），构建工程菌L. casei E1。在模拟玉米秸秆水解液中，E1的生长速率（0.14 h⁻¹）高于大肠杆菌（0.09 h⁻¹）和运动发酵单胞菌（0.08 h⁻¹）；在全部胁迫条件下，E1的比生长速率仅降低48%，而大肠杆菌降低80%。E1消耗葡萄糖113 mM并产乙醇77 mM，优于对照菌株，但副产乳酸84 mM。结果表明，干酪乳杆菌在木质纤维素水解液中具有优于传统底盘细胞的联合胁迫耐受性和产醇能力，是可行的生物燃料生产平台，进一步消除乳酸脱氢酶活性可提升乙醇得率。
创新点
['首次系统评估L. casei作为醇类生物催化剂的潜力', '构建了L. casei E1，在模拟木质纤维素水解液中表现出比E. coli和Z. mobilis更高的酒精耐受性、生长速率和乙醇产量', '揭示了L. casei在联合胁迫下的优势，并指出需进一步敲除其他乳酸脱氢酶以提高乙醇纯度']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Lactobacillus casei 12A | 丙酮酸代谢/乳酸发酵 | ldh1 | L-乳酸脱氢酶 | 催化 | L-乳酸脱氢酶基因；在工程菌E1中被敲除以阻断乳酸生成 |
| Lactobacillus casei E1 | 乙醇发酵（异源） | pdc, adhB | 丙酮酸脱羧酶（PDC）、乙醇脱氢酶（ADHII） | 催化 | 来自Zymomonas mobilis的PET cassette，在pgm启动子驱动下将丙酮酸转化为乙醇 |
| Lactobacillus casei 12A | 糖酵解 | pgm（启动子） | 磷酸甘油酸变位酶（Pgm） | 调控 | 利用pgm启动子（Ppgm）驱动PET cassette的表达；Pgm本身为糖酵解酶，此处主要利用其启动子 |
| Escherichia coli GLBRC E1 | 乙醇发酵（工程） | pflB, ldhA, ack | 丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶、乙酸激酶 | 催化 | pflB被PET cassette替换，ldhA和ack被敲除，以减少副产物并增强乙醇途径 |
| Zymomonas mobilis ATCC 31821 | 乙醇发酵（天然） | — | PDC、ADH | 催化 | 天然产乙醇菌株，作为对照生物催化剂 |
关键发现
- 在5株L. casei中，UW-1对乙醇的μmax耐受最高（50%抑制浓度7%），12A对ODmax耐受最高（乙醇9.21%）
- 12A转化效率为5.4×10^6 cfu/μg DNA。在mSynH中，L. casei E1的μmax=0.14 h^-1，高于E. coli（0.09 h^-1）和Z. mobilis（0.08 h^-1）
- 乙醇使μmax降低50%的浓度：E1为4.5%，E. coli为5.1%，Z. mobilis为3.8%
- 使ODmax降低50%的浓度：E1为6.8%，E. coli和Z. mobilis均为1.9%。异丁醇使μmax和ODmax降低50%的浓度：E1均为1.3%，E. coli和Z. mobilis分别为0.8%（μmax）和0.4%（ODmax）。在mSynH+全部胁迫条件下，L. casei E1的μmax仅降低48%，而E. coli降低80%
- E1消耗葡萄糖113 mM，产乙醇77 mM，高于E. coli（消耗34 mM，产61 mM）和Z. mobilis（消耗30 mM，产57 mM），但副产乳酸84 mM。木质毒素中，p-香豆酸对μmax抑制最强（从0.18 h^-1降至0.13 h^-1），阿魏酰胺对ODmax抑制最强（从1.84降至1.69）。
研究结论
L. casei E1在模拟玉米秸秆水解液胁迫条件下具有优于E. coli和Z. mobilis的生长、酒精耐受性和乙醇产量，证明L. casei是用于生物燃料生产的可行生物催化剂平台；通过消除乳酸脱氢酶活性可进一步提高乙醇得率。