Improved glycerol to ethanol conversion by E. coli using a metagenomic fragment isolated from an anaerobic reactor
- 作者
- Inés Loaces, Cecilia Rodríguez, Vanesa Amarelle, Elena Fabiano, Francisco Noya
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s10295-016-1818-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用宏基因组来源的异源基因提高大肠杆菌以粗甘油为底物发酵产乙醇的效率，尤其是增强甘油的运输或代谢能力。
研究策略
采用功能宏基因组学策略，从厌氧反应器污泥中构建fosmid宏基因组文库，筛选能在粗甘油上促进大肠杆菌生长的克隆；对阳性克隆G1进行全测序和Tn5插入突变定位关键基因G1_23；并在不同产乙醇菌株（EPI300/pLOI297和工业菌株LY180）中验证其对纯甘油和粗甘油发酵产乙醇的促进作用。
核心内容
本研究利用功能宏基因组学策略，从厌氧反应器污泥中构建fosmid宏基因组文库，筛选到一株能在粗甘油上促进大肠杆菌生长的阳性克隆G1。通过全测序和Tn5插入突变，定位了关键基因G1_23，该基因编码推定跨膜或胞外蛋白，可能参与甘油运输或代谢。在多个产乙醇菌株中验证了G1片段的作用：在EPI300（pLOI297）中以10%纯甘油为底物时，48小时乙醇产量从3.5 g/L提高到5.2 g/L，乙醇生产速率增加56%，甘油消耗增加30%；在工业菌株LY180中，以50%粗甘油且初始OD620=8.0发酵时，携带G1的菌株24小时乙醇产量达到75 g/L，对照为67 g/L，生产速率为0.39 g h⁻¹ OD⁻¹ L⁻¹。结果表明，宏基因组来源的G1片段能显著提高大肠杆菌在微需氧条件下对甘油（尤其是粗甘油）的利用和乙醇产量，G1_23基因可能通过增强甘油运输或代谢发挥关键作用，为以粗甘油为廉价碳源的商业化乙醇生产提供了新的遗传元件。
创新点
首次通过功能宏基因组学方法从环境DNA中筛选到能显著提高大肠杆菌甘油利用和乙醇产量的异源片段G1；定位并初步表征了关键基因G1_23，该基因与甘油运输或代谢相关，为优化甘油产乙醇提供了新遗传元件。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli EPI300-T1R | 甘油代谢/发酵产乙醇 | G1_23 | G1_23（推定跨膜/胞外蛋白） | 转运 | 功能未知，根据亚细胞定位和表型推测可能参与甘油转运或代谢，确切的机理尚未阐明。 |
| Escherichia coli LY180 | 甘油发酵产乙醇（PET途径） | pdc, adhB | 丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶（来自运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis） | 催化 | 质粒pLOI297携带PET操纵子，将丙酮酸转化为乙醇。 |
| Escherichia coli EPI300-T1R | 甘油发酵产乙醇（PET途径） | pdc, adhB | 丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶 | 催化 | 与G1 fosmid共同用于验证乙醇产量提升。 |
关键发现
- 存在fosmid G1时，在50%(v/v)纯甘油中乙醇浓度平均增加两倍，24h达到20 g/L
- 在50%粗甘油且初始OD620=8.0时，LY180携带G1的菌株24h乙醇产量达75 g/L，对照为67 g/L，比生产速率为0.39 g h^-1 OD^-1 L^-1
- 在EPI300（pLOI297）中，10%纯甘油48h乙醇产量由3.5 g/L提高到5.2 g/L，乙醇生产速率增加56%，甘油消耗增加30%
- 在LY180中，4%纯甘油时乙醇产量提高94%
- 50%粗甘油时G1额外增加10 g/L乙醇。
研究结论
中和并稀释的粗甘油是生产乙醇的优良廉价碳源；宏基因组片段G1能显著提高大肠杆菌在微需氧条件下的生长和乙醇产量，关键基因G1_23很可能参与甘油运输或代谢，使LY180(G1)能在24h内从50%粗甘油产生75 g/L乙醇，适合商业化生产。