高级醇 · 代谢工程文献库

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High-throughput FTIR-based bioprocess analysis of recombinant cyprosin production

作者
Pedro N. Sampaio, Kevin C. Sales, Filipa O. Rosa, Marta B. Lopes, Cecilia R. C. Calado
单位
Faculty of Engineering, Lusophone University of Humanities and Technology, Campo Grande, 376, 1749-019 Lisbon, Portugal; Faculty of Engineering, Catholic University of Portugal, Avenida Otávio Pato, 2635-631 Rio de Mouro, Portugal; Institute of Telecommunications, Technical Higher Institute University of Lisbon, Av. Rovisco Pais, 1049-001 Lisbon, Portugal; ISEL- Instituto Superior de Engenharia de Lisboa, Instituto Politécnico de Lisboa, Conselheiro Emídio Navarro Street, 1959-007 Lisbon, Portugal
杂志
Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2017）
DOI
10.1007/s10295-016-1865-0
所属领域
发酵工程
关键词
中红外光谱主成分分析偏最小二乘回归培养重组cyprosin高通量分析
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解决的核心问题

重组cyprosin生产过程中关键变量（生物量、酶活、碳源和代谢产物）的快速、经济、高通量监测，以支持过程优化和控制。

研究策略

利用中红外（MIR）光谱结合主成分分析（PCA）和偏最小二乘回归（PLS），在96孔硅微板中用微量样品高通量采集光谱，通过预处理和波长选择建立关键变量预测模型。

研究路线图

100%
研究问题：
重组cyprosin生产关键变量
快速高通量监测
研究策略：
MIR光谱+PCA/PLS
96孔硅微板高通量采样
关键改造1：
微量样品无需前处理
单次测量多变量
关键改造2：
PCA载荷识别
细胞分子指纹
关键改造3：
波长选择+预处理
优化PLS模型
关键结果：
PCA区分6个生长阶段
PC1+PC2解释96.3%方差
关键结果：
PLS预测生物量R²=0.99
酶活R²=0.98误差3.9%
关键结果：
碳源/代谢物预测
误差7.2%以内
结论：
高通量MIR+多变量分析
为QbD过程优化奠定基础
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核心内容

该研究将高通量中红外光谱技术应用于重组天冬氨酸蛋白酶cyprosin的酿酒酵母发酵过程监测。研究者使用96孔硅微板采集微量样品的MIR光谱，结合主成分分析和偏最小二乘回归建立关键变量的定量预测模型。PCA分析成功区分了培养的六个生长阶段，两个主成分解释了96.3%的方差，并通过载荷识别出与生长阶段相关的细胞分子指纹。所建PLS模型对多个关键变量均有良好预测精度：生物量预测R²达0.99，均方根误差为2.8%；cyprosin活性R²为0.98，误差3.9%；葡萄糖R²为0.93，半乳糖和乙醇R²均为0.97，乙酸R²为0.95，各变量预测误差均低于7.2%。发酵过程中最高蛋白酶活达2489 U/mL，最大比生长速率为0.338 h⁻¹。结果表明，该方法无需复杂样品前处理，即可从单一光谱中同时准确定量多个过程变量，为基于质量源于设计理念的工业发酵过程优化与控制提供了高效的分析工具。

创新点

首次将基于96孔板的高通量MIR光谱技术应用于重组cyprosin生物过程监测；通过PCA载荷识别出与生长阶段相关的细胞分子指纹（如蛋白质、核酸、脂质等）；无需复杂样品前处理，从单一测量中同时预测多个关键变量，误差低于7.2%。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae BJ1991 重组蛋白表达 CYPRO11 Cyprosin（天冬氨酸蛋白酶） 催化 来自Cynara cardunculus的花，克隆至酿酒酵母中表达，作为目标产物
Saccharomyces cerevisiae BJ1991 半乳糖代谢 GAL基因簇 — 催化 葡萄糖通过碳分解代谢物阻遏抑制GAL基因转录，半乳糖作为诱导剂促进cyprosin表达
Saccharomyces cerevisiae BJ1991 糖酵解/乙醇发酵 — — 能量供给 葡萄糖过量导致Crabtree效应，产生乙醇和乙酸，影响菌体生长和产物表达

关键发现

  1. 基于MIR光谱的PCA成功区分了酿酒酵母培养的六个生长阶段，两个主成分解释了96.3%的方差。建立的PLS模型可高精度预测关键变量：生物量R²=0.99，RMSEP=2.8%（0.34 g dcw/L）
  2. cyprosin活性R²=0.98，RMSEP=3.9%（87 U/mL）
  3. 葡萄糖R²=0.93，RMSECV=7.2%（0.68 g/L）
  4. 半乳糖R²=0.97，RMSEP=4.6%（0.39 g/L）
  5. 乙醇R²=0.97，RMSEP=5.3%（1.17 g/L）
  6. 乙酸R²=0.95，RMSEP=7.0%（0.07 g/L）。培养过程中最大比生长速率0.338 h⁻¹（葡萄糖相），乙醇最大浓度22.9 g/L，乙酸最大0.12 g/L，最高蛋白酶活2489 U/mL，最高比活力282.4 U/mg dcw。

研究结论

研究表明，高通量MIR光谱结合多变量数据分析能够有效识别重组cyprosin生产过程中的主要生长阶段和产物生产阶段，并准确定量生物过程关键变量，为基于质量源于设计（QbD）的未来过程优化和控制奠定了基础。