A homomeric geranyl diphosphate synthase-encoding gene from Camptotheca acuminata and its combinatorial optimization for production of geraniol in Escherichia coli

作者: Lixia Yang, Liangzhen Jiang, Wei Li, Yun Yang, Guolin Zhang, Yinggang Luo
单位: Center for Natural Products Research, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences; State Key Laboratory of Bioorganic and Natural Products Chemistry, Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences; University of Chinese Academy of Sciences
杂志: Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2017）
DOI: 10.1007/s10295-017-1967-3
所属领域: 代谢工程
关键词: Camptotheca acuminataFermentationGeraniolGeranyl diphosphate synthaseMetabolic engineering
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解决的核心问题

从喜树中克隆同源二聚体香叶基二磷酸合酶（CaGPPS）基因，并通过基因拷贝数优化和发酵条件优化提高大肠杆菌中香叶醇的产量。

研究策略

通过RACE技术克隆CaGPPS全长基因，构建不同拷贝数的tCaGPPS和tCaGES表达质粒组合，导入大肠杆菌进行发酵，并通过优化IPTG诱导时机、转速、补糖及有机溶剂双层萃取置换来提高香叶醇产量。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究从喜树中克隆并功能鉴定了首个同源二聚体香叶基二磷酸合酶基因CaGPPS，其编码419个氨基酸蛋白并含有两个保守DDXXD基序。通过RACE技术获得全长基因后，将该基因与香叶醇合酶基因CaGES以不同拷贝数组合导入大肠杆菌BL21(DE3)中，与甲羟戊酸途径联用进行香叶醇异源生产。初始重组菌香叶醇产量为24.0 mg/L，当tCaGPPS与tCaGES拷贝数比为4:1时产量提升1.6倍。进一步通过优化IPTG诱导时机、转速、补糖以及采用n-癸烷双层萃取置换策略，最终产量达74.6 mg/L，较初始提高3.1倍。研究还利用UPLC-HRMS直接验证了GPP的生成。结果表明，GPPS与GES的基因拷贝数比例对香叶醇高效合成至关重要，有机溶剂置换策略可有效缓解产物抑制，该组合优化策略为大肠杆菌规模化生产香叶醇及其他单萜类化合物提供了可行方案。

创新点

首次克隆并功能鉴定喜树中的同源二聚体GPPS（CaGPPS）；通过基因拷贝数比例优化（tCaGPPS:tCaGES=4:1）和有机溶剂置换策略，显著提高香叶醇产量；利用UPLC-HRMS直接验证GPP的产生。

研究对象（4）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli BL21(DE3)	甲羟戊酸（MVA）途径	CaGPPS	香叶基二磷酸合酶（GPPS）	催化	来源于喜树，截短形式tCaGPPS，催化IPP和DMAPP缩合生成GPP
Escherichia coli BL21(DE3)	单萜生物合成途径	CaGES	香叶醇合酶（GES）	催化	来源于喜树，截短形式tCaGES，催化GPP水解生成香叶醇
Escherichia coli BL21(DE3)	甲羟戊酸（MVA）途径	ispA	法尼基二磷酸合酶（FPP合酶）	催化	在pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO, ispA)中被tCaGPPS替换，以避免GPP向FPP转化
Escherichia coli BL21(DE3)	甲羟戊酸（MVA）途径	MevT(CO)、MBIS(CO)	MVA途径相关酶	催化	用于提供IPP和DMAPP前体，来自pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO, ispA)构建体

关键发现

初始重组菌产香叶醇24.0±1.3 mg/L
当tCaGPPS四拷贝、tCaGES一拷贝时产量提高1.6倍
经发酵优化（补糖和有机层置换）后产量达74.6±6.5 mg/L，较初始提高3.1倍
CaGPPS为419氨基酸蛋白，含两个保守DDXXD基序，属于同源二聚体GPPS。

研究结论

tCaGPPS与tCaGES的基因拷贝数比例（4:1）对香叶醇高产至关重要，去除有机层并补充新n-癸烷可实现可持续高产，该策略可用于大肠杆菌规模化生产香叶醇。