A regulated synthetic operon facilitates stable overexpression of multigene terpenoid pathway in Bacillus subtilis
- 作者
- Ingy I. Abdallah, Dan Xue, Hegar Pramastya, Ronald van Merkerk, Rita Setroikromo, Wim J. Quax
- 单位
- Department of Chemical and Pharmaceutical Biology, Groningen Research Institute of Pharmacy, University of Groningen; Pharmaceutical Biology Research Group, School of Pharmacy, Institut Teknologi Bandung
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2020）
- DOI
- 10.1007/s10295-019-02257-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在枯草芽孢杆菌中稳定过表达多基因萜类（MEP）途径，实现C30类胡萝卜素的高产
研究策略
构建包含MEP途径八个基因的合成操纵子，置于木糖诱导启动子下，采用theta复制质粒pHCMC04G实现稳定遗传；利用CPEC方法组装多基因，并比较不同复制方式的质粒稳定性
核心内容
该研究在枯草芽孢杆菌中构建了包含MEP途径八个基因（dxs、ispD、ispH、ispF、ispC、ispE、ispG、ispA）的合成操纵子，置于木糖诱导启动子下，并采用theta复制质粒pHCMC04G实现稳定遗传。通过CPEC方法组装多基因，并比较了theta复制与滚动环复制质粒的稳定性差异。关键结果显示，携带完整八基因操纵子的p04SDFHCEGA菌株产生约21 mg/g dcw的C30类胡萝卜素，约为对照菌株的20倍；theta复制质粒在100代无抗生素培养后保持超过85%的质粒保持率，而滚动环复制质粒丢失超过70%。此外，theta复制质粒中操纵子的转录水平在起始、中间和末端区域基本一致，而滚动环复制质粒构建的八基因操纵子无法获得且10代后仅有57%和62%的正确序列。这一成果表明，利用稳定的theta复制质粒表达完整MEP途径可显著提高萜类产量，结合枯草芽孢杆菌的GRAS状态和快速生长特性，该菌株有望成为工业萜类化合物生产的细胞工厂。
创新点
首次在B. subtilis中基于质粒稳定表达完整八基因MEP操纵子；采用theta复制质粒克服滚动环复制质粒的不稳定性；实现了C30类胡萝卜素的高产（约21 mg/g dcw）
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 (Dxs) | 催化 | MEP途径第一个酶，催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispD | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷转移酶 (IspD) | 催化 | MEP途径酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispH | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶 (IspH) | 催化 | MEP途径酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispF | 2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶 (IspF) | 催化 | MEP途径酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispC | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 (IspC) | 催化 | MEP途径酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispE | 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 (IspE) | 催化 | MEP途径酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispG | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶 (IspG) | 催化 | MEP途径酶 |
| Bacillus subtilis 168 | MEP途径 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 (IspA) | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成FPP，为C30类胡萝卜素提供前体 |
关键发现
p04SDFHCEGA菌株（过表达dxs, ispD, ispH, ispF, ispC, ispE, ispG, ispA八基因）产生约21 mg/g dcw类胡萝卜素，约为含pHYCrTMN对照菌株的20倍。theta复制质粒（pHCMC04G）在100代无抗生素培养后保持>85%的质粒保持率，而滚动环复制质粒（pHB201）丢失>70%。pHCMC04G菌株的操纵子转录水平在起始、中间和末端基本一致。pHB201构建的八基因操纵子无法获得，且10代后仅有57%和62%正确序列。
研究结论
成功构建了稳定过表达完整MEP途径的B. subtilis菌株，显著提高了C30类胡萝卜素产量，结合其GRAS状态和快速生长，有望成为生产萜类化合物的工业细胞工厂。