Functional expression of the astaxanthin biosynthesis genes from a marine bacterium, Paracoccus haeundaensis
- 作者
- Jae Hyung Lee, Young Tae Kim
- DOI
- 10.1007/s10529-006-9072-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在E. coli中功能表达海洋细菌Paracoccus haeundaensis的虾青素生物合成基因，并纯化表征各酶。
研究策略
将虾青素合成基因簇中六个基因（crtW、crtZ、crtY、crtI、crtB、crtE）分别克隆到pET-44a(+)载体，转化E. coli BL21(DE3) Codon Plus，经IPTG诱导表达，利用His标签亲和纯化重组蛋白，并通过酶活测定和Western blot表征。
核心内容
该研究将海洋细菌Paracoccus haeundaensis虾青素生物合成途径中的六个基因（crtW、crtZ、crtY、crtI、crtB、crtE）分别克隆至pET-44a(+)载体，并在E. coli BL21(DE3) Codon Plus中通过IPTG诱导实现功能表达。利用His标签亲和纯化获得各重组蛋白，经Western blot和酶活测定验证其正确性与催化功能。六个基因长度介于486至1503 bp之间，对应重组蛋白分子量为18至55 kDa；30°C诱导时重组蛋白占可溶性总蛋白的5–10%，纯化后蛋白浓度约0.5 mg/ml。酶活测定显示CrtB活性最高（210 pmol/h/mg），而CrtE、CrtI、CrtY、CrtZ和CrtW的活性依次为15、11、21、13和30 pmol/h/mg。这是首次实现该海洋细菌全部分虾青素合成基因在大肠杆菌中的高表达与纯化，证实了各酶具备独立催化活性，为后续体外重构虾青素合成途径及代谢工程改造奠定了基础。
创新点
首次实现了P. haeundaensis六个虾青素合成基因在E. coli中的高水平表达和纯化，确定了各酶的分子量及催化活性。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) Codon Plus | 虾青素生物合成途径 | crtE | CrtE | 催化 | GGPP合酶，催化FPP转化为GGPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) Codon Plus | 虾青素生物合成途径 | crtB | CrtB | 催化 | 八氢番茄红素合酶，催化GGPP生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) Codon Plus | 虾青素生物合成途径 | crtI | CrtI | 催化 | 八氢番茄红素脱氢酶，催化八氢番茄红素脱氢 |
| Escherichia coli BL21(DE3) Codon Plus | 虾青素生物合成途径 | crtY | CrtY | 催化 | 番茄红素β-环化酶，催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) Codon Plus | 虾青素生物合成途径 | crtZ | CrtZ | 催化 | β-胡萝卜素羟化酶，催化β-胡萝卜素羟基化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) Codon Plus | 虾青素生物合成途径 | crtW | CrtW | 催化 | β-胡萝卜素酮化酶，催化β-胡萝卜素酮基化 |
关键发现
- 基因大小：crtW 726 bp、crtZ 486 bp、crtY 1158 bp、crtI 1503 bp、crtB 912 bp、crtE 879 bp
- 重组蛋白分子量：CrtW 27 kDa、CrtZ 18 kDa、CrtY 42 kDa、CrtI 55 kDa、CrtB 33 kDa、CrtE 30 kDa
- 30°C诱导时重组蛋白占可溶性总蛋白的5-10%
- 最优诱导时间分别为6、3、6、3、3、3 h
- 纯化蛋白浓度约0.5 mg/ml
- 酶活性：CrtE 15 pmol/h/mg、CrtB 210 pmol/h/mg、CrtI 11 pmol/h/mg、CrtY 21 pmol/h/mg、CrtZ 13 pmol/h/mg、CrtW 30 pmol/h/mg。
研究结论
P. haeundaensis的虾青素生物合成基因可在E. coli中功能性表达，各基因产物能纯化至均一并具有催化活性，为解析虾青素合成机制及生物技术应用奠定了基础。