Increasing the catalytic performance of a whole cell biocatalyst harboring a cytochrome P450cam system by stabilization of an electron transfer component
- 作者
- Tsuyoshi Mouri, Norihio Kamiya, Masahiro Goto
- 杂志
- Biotechnology Letters（2006）
- DOI
- 10.1007/s10529-006-9118-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
重组大肠杆菌全细胞生物催化剂中，P450cam多组分单加氧酶系统因电子传递蛋白putidaredoxin（Pdx）不稳定而导致催化活性受限、反应提前达到平台期。
研究策略
利用定点突变获得稳定的Pdx突变体（C73S/C85S-Pdx），将其替代野生型Pdx与P450cam、PdR及GLD共表达于大肠杆菌中，构建全细胞催化系统并优化反应条件。
研究路线图
核心内容
本研究针对重组大肠杆菌全细胞生物催化剂中P450cam多组分单加氧系统因电子传递蛋白putidaredoxin（Pdx）不稳定而催化活性受限的问题，通过定点突变构建了稳定的Pdx突变体C73S/C85S-Pdx，并将其替代野生型Pdx与P450cam、PdR及甘油脱氢酶GLD共表达于大肠杆菌BL21(DE3)中，构建了全细胞催化樟脑羟基化系统。结果表明，使用C73S/C85S-Pdx突变体时，每mg干细胞在4°C、50mM Tris/HCl（pH 7.4）缓冲液中可羟基化约0.7 μmol樟脑，底物转化率较野生型Pdx提高约2倍；在20°C下，15mg干细胞在6h内可将10 μmol樟脑完全羟基化，2mM樟脑在20°C、6h内亦达完全转化。该研究首次证明，在多组分酶系统中稳定单个电子传递蛋白组分即可显著改善整体转化能力，为构建实用的P450全细胞催化剂提供了有效策略，拓展了通过稳定辅助蛋白提升全细胞催化性能的可行思路。
创新点
首次通过稳定P450cam系统中的电子传递蛋白（Pdx）来提升全细胞生物催化剂的催化效率；证明了在多组分酶系统中稳定单个蛋白组分可显著改善整体转化能力。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | camphor hydroxylation | P450cam | cytochrome P450cam monooxygenase | 催化 | 催化樟脑区域选择性羟基化生成5-exo-hydroxycamphor |
| Escherichia coli BL21(DE3) | camphor hydroxylation | PdR | putidaredoxin reductase | 转运 | NADH依赖的电子传递组分，将电子从NADH传递至Pdx |
| Escherichia coli BL21(DE3) | camphor hydroxylation | Pdx | putidaredoxin (wild-type) | 转运 | 含[2Fe-2S]簇的电子传递蛋白，不稳定，易失活 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | camphor hydroxylation | Pdx(C73S/C85S) | C73S/C85S-Pdx | 转运 | Cys73Ser/Cys85Ser双突变体，稳定性提高，替代野生型Pdx |
| Escherichia coli BL21(DE3) | NADH regeneration | GLD | glycerol dehydrogenase | 能量供给 | 通过氧化甘油再生NADH，为P450cam系统提供还原力 |
关键发现
- 使用C73S/C85S-Pdx突变体时，每mg干细胞在4°C、50mM Tris/HCl(pH 7.4)缓冲液中可羟基化约0.7 μmol樟脑，底物转化率较野生型Pdx提高约2倍
- 在20°C下，15mg干细胞在6h内可将10 μmol樟脑完全羟基化
- 在Fig.3B中，2mM樟脑在20°C、6h内达到完全转化。
研究结论
通过稳定多组分P450系统中的电子传递蛋白Pdx，可显著提高全细胞生物催化剂的催化性能，为构建实用的P450全细胞催化剂提供了有效策略。