Pathway engineering strategies for production of beneficial carotenoids in microbial hosts
- 作者
- Victor M. Ye, Sujata K. Bhatia
- 单位
- Keck School of Medicine, University of Southern California; School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University
- 杂志
- Biotechnology Letters（2012）
- DOI
- 10.1007/s10529-012-0921-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过代谢工程策略在微生物宿主中高效生产有益类胡萝卜素（如番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素），解决天然提取和化学合成成本高、产量低的问题。
研究策略
系统综述多种代谢工程策略，包括优化内源MEP途径、引入异源MVA途径、平衡关键酶表达、染色体整合稳定表达、蛋白工程改造、辅助碳源补加、原位萃取及氧供给优化等，在不同微生物宿主中实现类胡萝卜素的高产。
核心内容
该研究系统综述了通过代谢工程策略在微生物宿主中高效生产类胡萝卜素（番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素）的进展与途径。研究者归纳了多种策略，包括优化内源MEP途径、模块化引入异源MVA途径、协调关键酶表达、染色体整合稳定表达、蛋白工程、辅助碳源补加及原位萃取等。关键结果为：通过组合肺炎链球菌底部与粪肠球菌顶部的MVA途径模块，大肠杆菌β-胡萝卜素产量达465 mg/L；补充葡萄糖和L-阿拉伯糖协同促进MVA途径，使番茄红素产量达1350 mg/L、比产量32 mg/g细胞、生产率40 mg/L/h，为当时文献最高，分别是商业菌株的1.5倍和5.1倍。此外，利用转座子标记筛选染色体整合位点大幅提升类胡萝卜素含量，甲基营养菌中多拷贝表达crtW/crtZ使虾青素达4 mg/g细胞干重。该工作表明代谢工程改造微生物生产类胡萝卜素已接近甚至超过现有商业工艺，且类胡萝卜素的可视化特性使其成为验证代谢工程方法的理想模式系统。
创新点
总结了模块化组合MVA途径（如肺炎链球菌底部与粪肠球菌顶部组合）获得最高β-胡萝卜素产量；通过补充葡萄糖和L-阿拉伯糖协同促进MVA途径，使番茄红素产量和生产率达到文献最高；利用转座子标记筛选染色体整合位点大幅提升类胡萝卜素含量；在甲基营养菌中通过多拷贝crtW/crtZ和血红蛋白表达优化虾青素合成。
研究对象（27）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 过表达以增强IPP/DMAPP前体供应 |
| Escherichia coli | MEP途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 平衡表达以优化碳流 |
| Escherichia coli | MEP途径 | ispDF | MEP途径下游酶（IspD/IspF） | 催化 | 与dxs和idi一起过表达 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（MVA） | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 限速步骤，来自酵母的MVA途径 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径（MVA） | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 来自S. cerevisiae，去除反馈调节以增强通量 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPP合酶） | 催化 | 催化FPP→GGPP |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶（PSY） | 催化 | 两分子GGPP缩合为八氢番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 引入双键生成番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtY | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 将番茄红素环化为β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 在β-紫罗兰酮环3,3'位加羟基，生成玉米黄质 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtW | β-胡萝卜素酮醇酶 | 催化 | 在4,4'位加酮基，用于虾青素合成 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素合成途径 | crtW148 | β-胡萝卜素酮醇酶（来自Nostoc punctiforme） | 催化 | 用于无质粒系统，提高酮醇酶活性 |
| Escherichia coli | 类异戊二烯途径 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 用于玉米黄质途径的碳流优化 |
| Pseudomonas putida | 类胡萝卜素合成途径 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 在番茄红素耐受突变株中表达，玉米黄质产量达7 mg/g dcw |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | crtYB | 双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶 | 催化 | 来自X. dendrorhous，整合到染色体，β-胡萝卜素产量5.9 mg/g dry wt |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径（MVA） | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达结合酮康唑使β-胡萝卜素提高>200% |
| Saccharomyces cerevisiae | 类异戊二烯途径 | BTS1 | GGPP合酶 | 催化 | 过表达使β-胡萝卜素含量增加22倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | crtS | 虾青素合酶（细胞色素P450单加氧酶） | 催化 | 需与crtR共表达才能产生虾青素 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | crtR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 为CrtS提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | crtW | β-胡萝卜素酮醇酶 | 催化 | 细菌来源，在酵母中功能，虾青素产量29 μg/g dry wt |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素合成途径 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 与crtW共表达 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类异戊二烯途径 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 过表达提高碳流，虾青素产量451 μg/g dry wt |
| Methylomonas sp. | 类胡萝卜素合成途径 | crtW | β-胡萝卜素酮醇酶 | 催化 | 双拷贝crtW/双拷贝crtZ使虾青素占90% |
| Methylomonas sp. | 类胡萝卜素合成途径 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 双拷贝crtW/双拷贝crtZ使虾青素占90% |
| Methylomonas sp. | 氧供给（辅助代谢） | thbN1 | 截短血红蛋白 | 能量供给 | 表达血红蛋白基因改善氧依赖羟化酶/酮醇酶活性，提高虾青素 |
| Methylomonas sp. | 氧供给（辅助代谢） | thbN2 | 截短血红蛋白 | 能量供给 | 同thbN1 |
| Methylomonas sp. | 氧供给（辅助代谢） | thbO | 截短血红蛋白 | 能量供给 | 同thbN1 |
关键发现
- 采用组合MVA途径的大肠杆菌β-胡萝卜素产量达465 mg/L（MEP途径为390 mg/L）
- 通过辅助碳源补加，番茄红素产量达1,350 mg/L，细胞干重42 g/L，比产量32 mg/g细胞，生产率40 mg/L/h，为文献最高，比商业菌株Blakeslea trispora分别高1.5倍和5.1倍
- 过表达HMG-CoA还原酶并添加100 mg/L酮康唑使酿酒酵母β-胡萝卜素含量提高>200%达6.3 mg/g dry wt
- 玉米黄质在大肠杆菌中达2.4 mg/g dcw，恶臭假单胞菌突变株最高达7 mg/g dcw（51.3 mg/L），添加卵磷脂使体积产量提高4.7倍达239 mg/L
- 无质粒大肠杆菌虾青素占总类胡萝卜素95%，浓度1.4 mg/g dcw
- 甲烷氧化菌整合两拷贝crtW/crtZ后虾青素达4 mg/g dcw，占总类胡萝卜素90%，其中all-E异构体占89%
- 通过GGPP合酶过表达，X. dendrorhous产虾青素451 μg/g dcw
- 酿酒酵母中表达细菌crtW/crtZ获得虾青素29 μg/g dcw。
研究结论
代谢工程改造微生物生产类胡萝卜素已成为可持续且经济上可行的路线。通过优化前体供应、平衡异源酶表达及发酵条件，重组菌株的产量和生产率已接近甚至超过现有商业工艺。类胡萝卜素途径的可视化特性使其成为发展和验证代谢工程技术的模式系统。