Tricistronic overexpression of cytochrome P450cam, putidaredoxin, and putidaredoxin reductase provides a useful cell-based catalytic system
- 作者
- Donghak Kim, Paul R. Ortiz de Montellano
- 单位
- Department of Biological Sciences, Konkuk University, Seoul, Korea; Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, CA, USA
- 杂志
- Biotechnology Letters（2009）
- DOI
- 10.1007/s10529-009-0016-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
构建能够自给自足的P450催化系统，在大肠杆菌中表达P450cam及其两个还原伴侣蛋白，用于全细胞催化氧化樟脑和柠檬烯，以低成本生产精细化学品。
研究策略
采用三顺反子表达策略，将P450cam、putidaredoxin (Pd)和putidaredoxin reductase (PdR)的开放阅读框串联在单个启动子下游，通过T7基因前导序列连接并携带SD核糖体结合位点，转化E. coli DH5α；以IPTG诱导表达，并用全细胞进行樟脑和柠檬烯的生物转化。
研究路线图
核心内容
该研究构建了一个自给自足的全细胞P450催化系统，在大肠杆菌DH5α中利用三顺反子表达策略，将细胞色素P450cam及其两个还原伴侣蛋白putidaredoxin和putidaredoxin reductase的开放阅读框串联于单个启动子下游，通过T7基因前导序列和SD核糖体结合位点实现共表达。经IPTG诱导后，无需蛋白纯化即可直接进行全细胞催化。结果表明，P450全酶表达量超过500 nmol/L培养物，PdR活性约为30 nmol NBT还原/min/mL全细胞培养物。该系统能够将(1R)-(+)-樟脑氧化为5-exo-羟基樟脑，并能区域和立体特异性地将L-柠檬烯羟化为(-)-紫苏醇，且该产物为唯一生成物。这一自给自足的全细胞催化体系无需外源添加辅因子或纯化蛋白，为低成本生产(-)-紫苏醇等精细化学品提供了可行途径，同时也为孤儿P450酶的底物筛选和功能鉴定提供了实用工具。
创新点
首次实现了CYP101::Pd::PdR三顺反子在大肠杆菌中的功能表达；无需蛋白纯化即可进行全细胞催化；证明了P450cam可区域和立体特异性地将L-柠檬烯羟化为(-)-紫苏醇，为抗癌化合物生产提供新途径。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli DH5α | 樟脑/柠檬烯羟基化 | CYP101 (camC) | Cytochrome P450cam (CYP101) | 催化 | 催化樟脑5-exo羟基化和L-柠檬烯7-羟基化 |
| E. coli DH5α | 樟脑/柠檬烯羟基化 | putidaredoxin (Pd) | Putidaredoxin (Pd) | 能量供给 | 铁硫蛋白，将电子从PdR传递至P450cam |
| E. coli DH5α | 樟脑/柠檬烯羟基化 | putidaredoxin reductase (PdR) | Putidaredoxin reductase (PdR) | 能量供给 | 黄素蛋白，利用NADH还原Pd |
关键发现
- 成功构建并表达三顺反子系统，P450表达量超过500 nmol全酶/L培养物
- PdR活性约为30 nmol NBT还原/min/ml全细胞培养物
- 全细胞能氧化(1R)-(+)-樟脑生成5-exo-羟基樟脑（m/z 168），并氧化L-柠檬烯生成(-)-紫苏醇（唯一产物）。该自给自足系统具有低成本高产量生产精细化学品的潜力。
研究结论
本研究开发的三顺反子大肠杆菌全细胞催化系统可高效表达P450cam及其还原伴侣，实现对樟脑和柠檬烯的氧化转化，尤其可选择性地生产(-)-紫苏醇。该系统在精细化学品生产及孤儿P450底物筛选中具有应用前景。