Surface display of active lipase in Pichia pastoris using Sed1 as an anchor protein
- 作者
- Guo-dong Su, Xi Zhang, Ying Lin
- 杂志
- Biotechnology Letters（2010）
- DOI
- 10.1007/s10529-010-0270-4
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在毕赤酵母表面展示活性脂肪酶，以提高酶稳定性并降低游离酶成本
研究策略
将南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）基因与酿酒酵母的Sed1锚定蛋白C端编码序列融合，在甲醇诱导型启动子pAOX1控制下于毕赤酵母细胞表面表达，构建全细胞催化剂
核心内容
本研究利用酿酒酵母Sed1锚定蛋白，在毕赤酵母GS115表面展示南极假丝酵母脂肪酶B（CALB），构建全细胞催化剂。将CALB基因与Sed1 C端编码序列融合，置于甲醇诱导型启动子pAOX1控制下表达，通过免疫印迹和免疫荧光验证融合蛋白定位于细胞壁。结果显示，展示CALB的全细胞水解活性在培养120 h后超过220 U/g干细胞；经60°C保温2 h后保留约57%活性，而游离CALB在60°C仅10 min即损失至约15%，展示酶热稳定性显著提升。免疫印迹检测到融合蛋白分子量大于理论65 kDa，提示高度糖基化，且培养上清中未检出该蛋白，表明其以非共价方式附着于细胞壁。该工作首次在毕赤酵母中利用Sed1实现CALB表面展示，所构建的全细胞催化剂兼具高活性和增强的热稳定性，为工业应用中替代游离脂肪酶提供了可行方案。
创新点
首次使用Sed1锚定蛋白在毕赤酵母表面展示CALB，展示的CALB热稳定性显著高于游离酶
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 脂质水解/酯合成 | CALB | 南极假丝酵母脂肪酶B | 催化 | 模型蛋白，与FLAG标签及Sed1锚定蛋白融合表达 |
| Pichia pastoris GS115 | 细胞壁锚定 | SED1 | Sed1p | 区室化 | 来源于酿酒酵母，使用其C端338个氨基酸作为锚定结构域 |
| Pichia pastoris GS115 | 转录调控 | AOX1 | 醇氧化酶1启动子 | 调控 | 甲醇诱导型启动子，驱动融合蛋白CALBSeD1表达 |
关键发现
- 展示CALB的毕赤酵母全细胞水解活性在120 h培养后超过220 U/g干细胞
- 在60°C保温2 h后保留约57%活性，7 h后几乎完全丧失，而游离CALB在60°C 10 min仅保留约15%活性。融合蛋白CALBSeD1经免疫印迹证实存在于葡聚糖酶提取组分中，分子量大于理论65 kDa，表明高度糖基化
- 免疫荧光显示细胞边缘有绿色荧光，培养上清中未检出CALBSeD1。结论指出该融合蛋白非共价附着于毕赤酵母细胞壁。
研究结论
成功构建了基于Sed1锚定蛋白的毕赤酵母表面展示系统，CALB以附着方式锚定于细胞壁并保持高活性，热稳定性显著提升，所展示的CALB有望作为工业全细胞催化剂替代游离脂肪酶。