高级醇 · 代谢工程文献库

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Enhancement of xylitol production by attenuation of intracellular xylitol dehydrogenase activity in Candida tropicalis

作者
Byoung Sam Ko, Dong-Min Kim, Byoung Hoon Yoon, Suk Bai, Hyeon Yong Lee, Jung Hoe Kim, Il-Chul Kim
单位
Higher Education Center for Bioregulator Research, Chonnam National University; College of Veterinary Medicine, Chonnam National University; Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology; College of Bioscience and Biotechnology, Kangwon National University
杂志
Biotechnology Letters（2011）
DOI
10.1007/s10529-011-0558-z
所属领域
代谢工程
关键词
Candida tropicalisEnzyme engineeringFermentationXylitolXylitol dehydrogenase
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解决的核心问题

如何在不使用共底物（如甘油）的情况下提高热带假丝酵母的木糖醇产量，通过削弱胞内木糖醇脱氢酶（XDH）活性来减少木糖醇的进一步代谢。

研究策略

通过减少XDH基因拷贝数（单拷贝菌株XDH-5）和引入定点突变（D207A/I208R/F209S/N211R，即ARSdR突变，构建ARSdR-16菌株）来降低胞内XDH活性，并评估木糖醇发酵性能。

研究路线图

100%
研究问题：如何在不使用共底物的条件下提高木糖醇产量
核心策略：降低胞内XDH活性（减少基因拷贝数+定点突变）
关键改造：构建单拷贝菌株XDH-5（70%活性）
关键改造：ARSdR定点突变（D207A/I208R/F209S/N211R）
酶学结果：NAD⁺活性降至1%，NADP⁺活性提升48倍
发酵结果：ARSdR-16转化率75%，产率0.62 g/L/h（无需甘油）
结论：无需共底物即可实现高产量木糖醇生产，简化工艺、降低成本
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核心内容

本研究通过在热带假丝酵母中削弱胞内木糖醇脱氢酶活性，实现无共底物条件下木糖醇的高产。研究者构建了XDH基因单拷贝菌株XDH-5及携带ARSdR定点突变（D207A/I208R/F209S/N211R）的ARSdR-16菌株，突变改变了辅酶特异性，使XDH从偏好NAD+转为偏好NADP+。酶活测定显示，突变体对NAD+的比活降至野生型的约1%，对NADP+的比活提升至1.2 U/mg；胞内ARSdR-16的NAD+依赖活性仅为0.052 U/mg，NADP+依赖活性为0.75 U/mg。发酵实验中，野生型、XDH-5和ARSdR-16的木糖转化率分别为62%、64%和75%，体积产率分别为0.52、0.54和0.62 g/L/h。ARSdR-16在不添加甘油等共底物的条件下达到75%的木糖醇产率，且生长和发酵过程简单。这一策略不仅减少了木糖醇的进一步分解，还通过NADPH再生辅助细胞代谢，简化了工艺流程并降低生产成本，为工业木糖醇生产提供了有前景的代谢工程方案。

创新点

构建了XDH基因单拷贝菌株XDH-5和携带ARSdR突变XDH基因的菌株ARSdR-16；突变改变了XDH的辅酶特异性（由NAD+偏好转为NADP+偏好），在降低木糖醇分解的同时有助于NADPH再生，无需外源共底物即可实现高产量木糖醇生产。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Candida tropicalis ATCC 20336 木糖代谢途径（木糖→木糖醇→木酮糖） XYL2 木糖醇脱氢酶（XDH） 催化 野生型XDH，催化木糖醇氧化为D-木酮糖，依赖NAD+
Candida tropicalis BSXDH-3（XYL2缺陷菌株） 木糖代谢途径 XYL2（ARSdR突变：D207A/I208R/F209S/N211R） 突变体XDH（ARSdR） 催化 定点突变改变辅酶特异性，使NAD+活性降至约1%，NADP+活性提高约48倍；构建的ARSdR-16菌株无需共底物即可实现高木糖醇产率
Escherichia coli BL21(DE3) 重组蛋白表达 XYL2（野生型及ARSdR突变型） 重组XDH及突变体XDH 催化 用于表达、纯化及酶活性测定

关键发现

  1. 野生型XDH对NAD+和NADP+的比活分别为3.5和0.025 U/mg
  2. ARSdR突变体对NAD+比活降至0.034 U/mg（约为野生型的1%），对NADP+比活提高至1.2 U/mg（约为野生型NAD+活性的34%）。胞内XDH活性测定显示，XDH-5和ARSdR-16的XDH活性分别为野生型的70%和40%（ARSdR-16的NAD+依赖活性仅为0.052 U/mg，NADP+依赖活性为0.75 U/mg）。在木糖醇发酵中，野生型、XDH-5和ARSdR-16的木糖转化率分别为62%、64%和75%，体积产率分别为0.52、0.54和0.62 g/L/h。ARSdR-16在不添加甘油等共底物的条件下达到75%的木糖醇产率，且生长和发酵过程简单。

研究结论

通过减弱热带假丝酵母胞内木糖醇脱氢酶活性，特别是利用NADP+依赖性的ARSdR突变体，可在不添加共底物的情况下实现高产量和高生产率的木糖醇生产，简化工艺流程并降低生产成本，是一种有前景的木糖醇生产方法。