Increase of ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae by error-prone whole genome amplification
- 作者
- Annette Lin Luhe, Lily Tan, Jinchuan Wu, Hua Zhao
- 单位
- Industrial Biotechnology Program, Institute of Chemical and Engineering Sciences, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 1 Pesek Road, Jurong Island 627833, Singapore
- 杂志
- Biotechnology Letters（2011）
- DOI
- 10.1007/s10529-011-0518-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高酿酒酵母的乙醇耐受性，传统基因组改组和全局转录机器工程存在技术局限，如原生质体制备复杂、转录因子未明等，缺乏简便高效的全基因组操作手段。
研究策略
采用易错全基因组扩增(ep-WGA)引入随机点突变，将PCR产物转化回亲本菌株进行同源重组，构建突变体库，并通过多轮乙醇浓度递增筛选获得高耐受菌株；后续通过基因组片段交换（SauI消化）组合有益突变。
核心内容
该研究针对酿酒酵母乙醇耐受性提升需求，发展了一种基于易错全基因组扩增（ep-WGA）的定向进化方法。该方法通过引入随机点突变并利用同源重组将扩增产物整合回亲本菌株，绕过了传统基因组改组中复杂的原生质体制备与再生步骤，简化了操作流程。以INVSc1为出发菌株，经过多轮乙醇浓度递增筛选，获得一系列耐受性逐步提升的突变体。具体而言，亲本菌株仅能在6%乙醇和100 g/L葡萄糖条件下生长，首轮ep-WGA筛选得到耐受7%乙醇的突变体GS-116，以其为亲本再经两轮进化获得耐受8.5%乙醇的菌株，最终通过SauI消化的基因组片段交换组合有益突变，筛选得到可在9%（v/v）乙醇和100 g/L葡萄糖下生长的突变体。此外，观测到乙醇浓度升高时突变体生长速率下降，提示维持能量需求增加。该策略成功将乙醇耐受性提高约50%，为微生物复杂表型工程提供了一种简便高效的新途径。
创新点
开创了基于易错全基因组扩增的定向进化方法，省略了原生质体制备和细胞壁再生步骤，简化了基因组改组流程，可快速实现复杂表型的改善。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 乙醇耐受相关代谢网络 | — | — | — | 通过易错全基因组扩增引入随机突变，多轮筛选提高乙醇耐受性，未特定单个基因或蛋白。 |
关键发现
- 亲本菌株S. cerevisiae INVSc1只能在6% (v/v)乙醇和100 g葡萄糖/L下生长
- 经第一轮ep-WGA筛选获得7%乙醇耐受突变体GS-116
- 以GS-116为亲本再经两轮进化获得8.5%乙醇耐受菌株
- 最终通过基因组片段交换和三轮筛选获得能在9% (v/v)乙醇和100 g葡萄糖/L下生长的突变体。同时观察到乙醇浓度升高时突变体生长速率下降，表明维持能量需求增加。
研究结论
易错全基因组扩增结合同源重组成功提高了酿酒酵母的乙醇耐受性，为微生物复杂表型工程提供了一种简便有效的替代传统基因组改组的新方法。