Key cytomembrane ABC transporters of Saccharomyces cerevisiae fail to improve the tolerance to D-limonene
- 作者
- Feifei Hu, Jidong Liu, Guocheng Du, Zhaozhe Hua, Jingwen Zhou, Jian Chen
- 杂志
- Biotechnology Letters（2012）
- DOI
- 10.1007/s10529-012-0931-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
D-柠檬烯对酿酒酵母具有毒性，限制了含柠檬烯柑橘皮废料的生物燃料生产及单萜类化合物的代谢工程改造，需提高酵母对D-柠檬烯的耐受性。
研究策略
利用实时定量PCR分析D-柠檬烯胁迫下酿酒酵母主要细胞膜ABC转运蛋白基因的转录水平，并构建过表达菌株测试其对D-柠檬烯耐受性的影响。
核心内容
该研究系统考察了酿酒酵母主要细胞膜ABC转运蛋白能否提升其对D-柠檬烯的耐受性。研究发现85 mg/L的D-柠檬烯可抑制酵母生长但不致死，510 mg/L则完全致死；在85 mg/L胁迫下，PDR5、PDR15和YOR1的转录水平上调超过两倍，其余转运蛋白基因下调。研究者随后分别过表达了11个ABC转运蛋白基因及2个调控因子，但所有过表达菌株在4小时和8小时的生物量均与对照无显著差异，平板点样实验也未观察到耐受性改善。结果表明，这些ABC转运蛋白并不能有效外排D-柠檬烯，其原因在于D-柠檬烯作为小疏水分子可快速跨膜扩散，不依赖主动转运机制；因此过表达转运蛋白无法提高酵母耐受性。该发现否定了通过强化ABC转运系统增强单萜耐受性的常规策略，提示应转向调节细胞膜组分等新方向来提升宿主对D-柠檬烯等单萜类化合物的耐受能力，对柑橘皮废料生物转化和单萜代谢工程改造具有重要指导意义。
创新点
系统评价了11个主要细胞膜ABC转运蛋白基因及2个调控因子在D-柠檬烯耐受中的作用，发现过表达这些转运蛋白不能提高耐受性，表明ABC转运蛋白并非D-柠檬烯耐受的关键机制。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | PDR5 | Pdr5p | 转运 | 在85 mg/l D-柠檬烯胁迫下转录水平上调超过两倍，过表达未提高耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | PDR15 | Pdr15p | 转运 | 在85 mg/l D-柠檬烯胁迫下转录水平上调超过两倍，过表达未提高耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | YOR1 | Yor1p | 转运 | 在85 mg/l D-柠檬烯胁迫下转录水平上调超过两倍，过表达未提高耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | PDR1 | Pdr1p | 调控 | 调控因子，转录水平未与PDR5等同步上调 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | PDR3 | Pdr3p | 调控 | 调控因子，转录水平未与PDR5等同步上调 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | PDR12 | Pdr12p | 转运 | 过表达未提高D-柠檬烯耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | SNQ2 | Snq2p | 转运 | 过表达未提高D-柠檬烯耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | AUS1 | Aus1p | 转运 | 主要转运甾醇，过表达未提高D-柠檬烯耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | PDR11 | Pdr11p | 转运 | 主要转运甾醇，过表达未提高D-柠檬烯耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | STE6 | Ste6p | 转运 | 过表达未提高D-柠檬烯耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | PDR（多效耐药）通路 | PDR10 | Pdr10p | 转运 | 主要转运甾醇，过表达未提高D-柠檬烯耐受性 |
关键发现
- 85 mg D-柠檬烯/l抑制酿酒酵母生长但不致死，510 mg/l致死
- 在85 mg/l胁迫下PDR5、PDR15和YOR1转录水平上调超过两倍，其余基因下调
- 分别过表达11个ABC转运蛋白基因后，4 h和8 h的生物量与对照无显著差异，平板点样实验也未显示耐受性提高。
研究结论
ABC转运蛋白不能有效转运D-柠檬烯，因为D-柠檬烯是小疏水分子可快速跨膜扩散，过表达这些转运蛋白无法改善酵母对D-柠檬烯的耐受性，建议通过调节细胞膜组分等新策略提高单萜耐受性。