Genetic modifications and introduction of heterologous pdc genes in Enterococcus faecalis for its use in production of bioethanol
- 作者
- N. F. Rana, S. Gente, A. Rincé, Y. Auffray, J. M. Laplace
- 杂志
- Biotechnology Letters（2012）
- DOI
- 10.1007/s10529-012-0964-x
- 所属领域
- 代谢工程 / 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过基因改造使 Enterococcus faecalis 具备高效生产生物乙醇的能力，克服乳酸菌天然偏向乳酸发酵的问题。
研究策略
敲除乳酸脱氢酶基因（ldh1、ldh2）以阻断乳酸合成途径，并引入异源丙酮酸脱羧酶基因（pdcSv 或 pdcCa）替换 ldh1，将丙酮酸代谢流导向乙醇；利用内源醛-醇脱氢酶（adhE）完成乙醇生成，同时使用表达质粒增强 pdc 表达。
研究路线图
核心内容
该研究以粪肠球菌JH2-2为底盘，通过组合敲除乳酸脱氢酶基因ldh1和ldh2阻断乳酸合成，并分别引入来自Sarcina ventriculi和Clostridium acetobutylicum的异源丙酮酸脱羧酶基因pdcSv与pdcCa替换ldh1，将丙酮酸代谢流导向乙醇，借助内源醛-醇脱氢酶完成乙醇生成。结果显示，敲除ldh基因使乙醇产量从野生型的0.25 g/L提升至0.82 g/L，在Δldh2背景下以pdc替换ldh1后进一步增至0.96 g/L。以乳糖为碳源并利用pMSP3535质粒经1 μg/mL nisin诱导时，pdcCa的PDC比活最高达47 U/mg，乙醇浓度达2.3 g/L，同时ldh1缺失使乳酸产量降低80%，转录分析显示adhE表达上调最高16倍。研究表明，引入源自C. acetobutylicum的pdc基因可显著提升粪肠球菌产乙醇能力，但丙酮酸分流仍不彻底，甲酸和乙酸副产物较多，需进一步优化pdc表达和辅因子平衡以提高产率。
创新点
首次在 E. faecalis JH2-2 中通过组合敲除 ldh 和替换异源 pdc 基因实现乙醇产量提升；证实来自 Clostridium acetobutylicum 的 pdc 基因在革兰氏阳性菌中具有高效表达潜力，可作为乙醇生产工程的新选择。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Enterococcus faecalis JH2-2 | 乳酸发酵途径 | ldh1 | L-乳酸脱氢酶 | 催化 | 敲除此基因以减少乳酸生成，其缺失对乳酸产量影响更大 |
| Enterococcus faecalis JH2-2 | 乳酸发酵途径 | ldh2 | L-乳酸脱氢酶 | 催化 | 敲除此基因，其表达受氧气和碳源影响 |
| Enterococcus faecalis JH2-2 | 乙醇发酵途径 | pdcSv | 丙酮酸脱羧酶（来自Sarcina ventriculi） | 催化 | 替换ldh1位点，在乳糖上比活13.6 U/mg |
| Enterococcus faecalis JH2-2 | 乙醇发酵途径 | pdcCa | 丙酮酸脱羧酶（来自Clostridium acetobutylicum） | 催化 | 替换ldh1位点或经质粒表达，最高比活47 U/mg，乙醇2.3 g/l |
| Enterococcus faecalis JH2-2 | 乙醇发酵途径 | adhE | 醛-醇脱氢酶（双功能） | 催化 | 内源基因，在ldh缺失突变体中表达上调最高16倍，负责将乙酰-CoA转化为乙醇 |
关键发现
- 野生型 E. faecalis JH2-2 以葡萄糖为碳源时乙醇产量为
- 25 g/l；敲除 ldh 基因后乙醇产量提高到
- 82 g/l；在 Δldh2 背景下用 pdc 替换 ldh1 后乙醇产量进一步增至
- 96 g/l。以乳糖为碳源时，pdcSv 和 pdcCa 的 PDC 比活分别为
- 6 和
- 6 U/mg；使用 pMSP3535 表达质粒和 1 μg nisin/ml 诱导时，PDC 最高活性达 47 U/mg，乙醇浓度达
- 3 g/l。此外，ldh1 缺失在乳糖条件下使乳酸产量降低达 80%。转录分析显示 adhE 基因表达上调最高达 16 倍。
研究结论
通过敲除 ldh 基因并引入异源 pdc 基因，特别是来自 C. acetobutylicum 的 pdcCa，可显著提高 E. faecalis 的乙醇产量，但丙酮酸分流仍不彻底，甲酸和乙酸副产物较多，需要进一步优化（如增强 pdc 表达、调节辅因子平衡）以实现更高乙醇产率。