Characterization of a monoterpene synthase from Paeonia lactiflora producing α-pinene as its single product

作者: Xiaohui Ma, Juan Guo, Ying Ma, Baolong Jin, Zhilai Zhan, Yuan Yuan, Luqi Huang
单位: Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs, National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences; Beijing Key Laboratory of Protection and Application of Chinese Medicinal Resources, Beijing Normal University
杂志: Biotechnology Letters（2016）
DOI: 10.1007/s10529-016-2098-z
所属领域: 代谢工程
关键词: Monoterpene synthasePaeonia lactifloraPaeoniflorin biosynthesisTerpene synthaseα-Pinene
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解决的核心问题

克隆并鉴定来自芍药（Paeonia lactiflora）的参与芍药苷生物合成的单萜合酶，该酶催化GPP生成α-pinene。

研究策略

从芍药转录组中克隆两个萜烯合酶基因，通过系统发育分析和序列特征预测功能，在E. coli中异源表达并用GC-MS检测体外酶活，以确定其催化产物。

研究路线图

100%

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核心内容

本研究从芍药转录组中克隆了两个萜烯合酶基因PIPIN和PITPS2，并在大肠杆菌中异源表达，通过体外酶活分析结合GC-MS鉴定其催化产物。系统发育分析表明PIPIN与柠檬烯合酶具有较高相似性（53%），该基因编码592个氨基酸、预测分子量69 kDa的蛋白，其N端含有质体转运肽，并具备RRX8W和DDXXD两个典型萜烯合酶保守基序。体外酶活测定显示，重组PIPIN蛋白以牻牛儿基焦磷酸（GPP）为唯一底物时，仅生成α-pinene一种单萜产物，对NPP、FPP和GGPP均无催化活性，而PITPS2在相同条件下未检测到任何产物。这是首次从芍药中鉴定出以α-pinene为唯一产物的单萜合酶，其严格的底物专一性和产物单一性不同于多数可产生多种产物的单萜合酶。该发现不仅为芍药苷生物合成途径提供了关键酶学证据，也为利用合成生物学手段在微生物中高效生产α-pinene提供了新的基因元件，但其在芍药体内的生物学功能仍有待通过反向遗传学手段进一步验证。

创新点

首次在芍药中鉴定出以α-pinene为唯一产物的单萜合酶基因PIPIN；与大多数单萜合酶不同，PIPIN对底物GPP具有专一性，不产生其他副产物。

研究对象（3）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli Transetta (DE3)	单萜生物合成	PIPIN	α-pinene synthase	催化	催化GPP生成α-pinene，产物单一；对NPP、FPP、GGPP无活性
Escherichia coli Transetta (DE3)	倍半萜生物合成（推测）	PITPS2	PITPS2	催化	与葡萄倍半萜合酶相似，但体外未检测到催化活性，功能待研究
Paeonia lactiflora	芍药苷生物合成	PIPIN	α-pinene synthase	催化	参与芍药苷骨架α-pinene的形成，体内功能需进一步验证

关键发现

PIPIN基因（KU187411）编码592个氨基酸的蛋白，预测分子量69 kDa
PITPS2基因（KU187412）编码554个氨基酸，预测分子量63.7 kDa。PIPIN与柠檬(+)-柠檬烯合酶2的序列相似性为53%。体外酶活分析显示，重组PIPIN蛋白以GPP为底物时仅生成α-pinene一种产物，以NPP、FPP、GGPP为底物时均无产物生成。PITPS2在同样条件下未检测到任何催化产物。PIPIN具有N端转运肽，定位于质体
含有RRX8W和DDXXD保守基序。

研究结论

本研究从芍药中鉴定了一个新的α-pinene合酶（PIPIN），它专一性地催化GPP生成α-pinene，可作为代谢工程提高芍药苷积累或合成生物学生产α-pinene的工具。该酶的体内功能仍需通过RNAi、VIGS或CRISPR/Cas9等进一步验证。