Cloning and characterization of three ketoreductases from soil metagenome for preparing optically active alcohols
- 作者
- Zhiqiang Zhao, Hualei Wang, Yiping Zhang, Lifeng Chen, Kai Wu, Dongzhi Wei
- 杂志
- Biotechnology Letters（2017）
- DOI
- 10.1007/s10529-016-2167-3
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
从土壤宏基因组中发掘新型酮还原酶（KRED），用于不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性醇，解决现有酮还原酶对映选择性和催化效率不足的问题。
研究策略
基于土壤宏基因组序列分析，克隆三个候选酮还原酶基因，在大肠杆菌中异源表达、纯化，通过酶学性质表征和底物谱分析，并利用枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶（BsGDH）构建NADPH再生系统评价其不对称还原能力。
研究路线图
核心内容
本研究从土壤宏基因组中克隆了三个新型酮还原酶基因KRED424、KRED432和KRED433，并在大肠杆菌中异源表达和纯化。三个酶均依赖NADPH，最适温度为55°C、最适pH为7，金属离子对其活性无显著影响。在底物谱方面，KRED424对17种测试底物均有活性，KRED432仅对酮酯和杂环酮有活性，KRED433对COBE活性最高，比活力达1.837 U/mg。动力学分析显示，KRED433对COBE具有最优催化效率，kcat/Km为232 M⁻¹s⁻¹。利用枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶构建NADPH再生系统进行不对称还原评价：对20 mM COBE，KRED424和KRED433均实现完全转化，其中KRED433产(R)-型产物ee达94%，KRED424产(S)-型产物ee为52%；对OPBE，KRED424转化率达91.5%且产(S)-型产物ee达99.4%；对N-Boc-3-吡咯烷酮，三个酶均产(S)-型产物，KRED424和KRED433转化率接近100%且ee达100%。这些结果表明，所获得的酮还原酶在制备光学活性醇方面具有良好应用潜力，尤其KRED433和KRED424可作为他汀类及血管紧张素转化酶抑制剂等药物手性中间体合成的候选生物催化剂。
创新点
首次从土壤宏基因组中克隆并表征三个新型酮还原酶；KRED433对COBE还原获得(R)-型产物，ee达94%；KRED424底物谱广，对OPBE和N-Boc-3-吡咯烷酮具有高对映选择性（>99% ee）。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 不对称还原 | KRED424 | KRED424 | 催化 | 来自土壤宏基因组，属于锌依赖中链醇脱氢酶/肉桂醇脱氢酶家族；GenBank KU196786 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 不对称还原 | KRED432 | KRED432 | 催化 | 来自土壤宏基因组，属于肉桂醇脱氢酶家族；GenBank WP_032063522 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 不对称还原 | KRED433 | KRED433 | 催化 | 来自土壤宏基因组，属于醛酮还原酶(AKR)家族；GenBank KU196787 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 辅因子再生 | BsGDH | BsGDH | 能量供给 | 来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶，用于NADPH再生；GenBank WP_041340171 |
关键发现
- 三个酮还原酶（KRED424、KRED432、KRED433）最适温度为55°C，最适pH为7
- 均依赖NADPH，不利用NADH
- 金属离子（2 mM）无显著影响。KRED424底物谱最广，对17种测试底物均有活性
- KRED432仅对酮酯和杂环酮有活性
- KRED433对COBE活性最高（1.837 U/mg）。动力学参数：KRED424对COBE的Km=3.2 mM，kcat=0.31 s^-1，kcat/Km=94.4 M^-1 s^-1
- KRED433对COBE的Km=5.9 mM，kcat=1.37 s^-1，kcat/Km=232 M^-1 s^-1
- KRED433对OPBE的Km=2.9 mM，kcat=0.03 s^-1
- KRED432对N-Boc-3-吡咯烷酮的Km=3.4 mM，kcat=0.05 s^-1。不对称还原结果：对20 mM COBE，KRED424和KRED433完全转化，KRED433产(R)-型产物ee=93.9%（文本94%），KRED424产(S)-型ee=52.3%
- 对OPBE，KRED424转化率91.5%，产(S)-型ee=99.4%，KRED432转化率75.9%，ee=77.1%（S），KRED433转化率86.1%，产(R)-型ee=74.8%
- 对N-Boc-3-吡咯烷酮，三个酶均产(S)-型，KRED424转化率96.9%，ee=100%，KRED432转化率99%，ee=99%，KRED433转化率100%，ee=100%。所有酶在pH 7以上稳定，KRED432和KRED433在pH 6-10保留>70%活性，KRED433在55-65°C较敏感。
研究结论
三个酮还原酶在不对称还原制备手性醇方面具有应用潜力，可用于药物中间体（如他汀类、血管紧张素转化酶抑制剂等）的合成。