Ectopic expression of a fruit phytoene synthase from Citrus paradisi Macf. promotes abiotic stress tolerance in transgenic tobacco
- 作者
- Luciana C. Cidade, Tahise M. de Oliveira, Amanda F. S. Mendes, Amanda F. Macedo, Eny I. S. Floh, Abelmon S. Gesteira, Walter S. Soares-Filho, Marcio G. C. Costa
- 单位
- Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilheus-BA 45662-900, Brazil; Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo-SP 05422-970, Brazil; Embrapa Mandioca e Fruticultura, Cruz das Almas-BA 44380-000, Brazil
- 杂志
- Molecular Biology Reports（2012）
- DOI
- 10.1007/s11033-012-1895-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
验证除单子叶PSY3外的其他PSY（如双子叶水果来源的CpPSY）异源表达是否也能通过提高ABA合成来增强植物的非生物胁迫耐受性。
研究策略
将葡萄柚果实特异性八氢番茄红素合酶基因CpPSY在CaMV 35S启动子驱动下转入烟草，通过PCR和Southern blot鉴定转基因株系，检测CpPSY表达量、拷贝数及ABA含量，并进行PEG、NaCl和甘露醇渗透胁迫下的表型分析，同时检测胁迫响应基因表达。
核心内容
该研究将葡萄柚果实特异性八氢番茄红素合酶基因CpPSY置于CaMV 35S启动子下转入烟草，旨在验证双子叶水果来源的PSY能否像单子叶PSY3一样通过促进ABA合成增强植物非生物胁迫耐受性。通过PCR和Southern blot鉴定转基因株系后，检测了CpPSY表达量、拷贝数及内源ABA含量，并在PEG、NaCl和甘露醇渗透胁迫下进行表型分析及胁迫响应基因表达检测。结果显示，转基因烟草在多种渗透胁迫下耐受性显著增强：野生型在胁迫下根长和地上部生物量降低约5倍，而转基因系仅降低约2倍。ABA含量与拷贝数正相关，双拷贝高表达株系L1的ABA含量约为野生型的10倍，单拷贝中表达株系L13仅约1.1倍。在L1中，NCED1、CAT、GST、LEA5、ERD10C和ERD10D等胁迫响应基因的mRNA水平均显著高于野生型。该工作首次证明非PSY3类双子叶水果PSY也能通过提升ABA水平及上调胁迫相关基因表达来增强作物耐旱耐盐性，为利用这类基因改良作物抗逆性提供了新依据。
创新点
首次证明双子叶水果来源的PSY（CpPSY）异位表达可模拟单子叶PSY3在ABA生物合成和胁迫耐受中的功能，为利用非PSY3类PSY基因改良作物耐旱耐盐性提供了新依据。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Havana） | 类胡萝卜素生物合成 / ABA生物合成 | CpPSY | 八氢番茄红素合酶（Phytoene synthase, PSY） | 催化 | 来源于葡萄柚（Citrus paradisi）果实，在CaMV 35S启动子下组成型表达，是类胡萝卜素合成的第一步限速酶，通过增加类胡萝卜素前体流量促进ABA合成。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Havana） | ABA生物合成 | NCED1 | 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase） | 催化 | ABA合成关键酶，在L1株系中表达显著上调。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Havana） | 活性氧清除 | CAT | 过氧化氢酶（Catalase） | 催化 | 清除ROS，在L1株系中表达显著上调。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Havana） | 活性氧清除 / 解毒 | GST | 谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase） | 催化 | 参与ROS清除和解毒，在L1株系中表达显著上调。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Havana） | 脱水保护 | LEA5 | 第5组LEA蛋白（Late embryogenesis abundant protein group 5） | 调控 | 脱水保护蛋白，在L1和L12中均显著上调。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Havana） | 脱水保护 | ERD10C / ERD10D | 第2组LEA蛋白（LEA protein group 2） | 调控 | 脱水保护蛋白，在L1中显著上调。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Havana） | 选择标记 | nptII | 新霉素磷酸转移酶II（Neomycin phosphotransferase II） | 催化 | 用于转基因植株的卡那霉素抗性筛选。 |
| 烟草（Nicotiana tabacum cv. Havana） | 报告基因 | GUS (uidA) | β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase） | 催化 | 用于GUS组织化学染色验证转基因阳性。 |
关键发现
- 转基因烟草在PEG、NaCl和甘露醇胁迫下表现出显著增强的耐受性
- WT烟草胁迫下根长和地上部生物量降低约5倍，而转基因系仅降低约2倍。ABA含量测定显示，双拷贝高表达株系L1的ABA含量约为WT的10倍，单拷贝高表达株系L2约为5倍，单拷贝中表达株系L12约为3倍，L13约为1.1倍。拷贝数与ABA水平及胁迫耐受性呈正相关。在L1中，NCED1、CAT、GST、LEA5、ERD10C和ERD10D等胁迫响应基因的mRNA水平均显著高于WT
- 在L12中，仅LEA5显著上调。
研究结论
CpPSY的异位表达通过提高内源ABA水平和上调胁迫响应基因表达，增强了转基因烟草对渗透胁迫的耐受性，表明PSY是ABA生物合成的关键调控酶，其他PSY（非PSY3）也可作为作物耐旱耐盐基因工程改良的候选基因。