Molecular characterization and expression analysis of dihydroflavonol 4-reductase (DFR) gene in Saussurea medusa
- 作者
- Houhua Li, Jian Qiu, Fudong Chen, Xiaofen Lv, Chunxiang Fu, Dexiu Zhao, Xuejun Hua, Qiao Zhao
- 单位
- Key Laboratory of Photosynthesis and Environmental Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences; Forage Improvement Division, The Samuel Roberts Noble Foundation; Plant Biology Division, The Samuel Roberts Noble Foundation; College of Forestry, Northwest A&F University
- 杂志
- Molecular Biology Reports（2011）
- DOI
- 10.1007/s11033-011-1061-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表征珍稀药用植物水母雪莲（Saussurea medusa）中二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）基因，揭示其生化功能与组织表达模式，为类黄酮生物合成途径的遗传改良奠定基础
研究策略
从红色愈伤组织cDNA文库中通过PCR筛选获得SmDFR全长cDNA；利用生物信息学分析其序列与结构；在酿酒酵母中异源表达并进行体外酶活测定（HPLC-MS检测产物）；通过实时定量PCR分析不同组织中的表达水平
核心内容
从珍稀药用植物水母雪莲的红色愈伤组织cDNA文库中克隆获得二氢黄酮醇4-还原酶基因SmDFR全长cDNA，其开放阅读框为1029 bp，编码342个氨基酸，预测分子量约38.6 kDa；对应的基因组序列包含6个外显子和5个内含子。氨基酸序列分析显示SmDFR与菊科植物DFR高度同源，其中与斑点矢车菊的一致性达91%。将SmDFR在酿酒酵母中异源表达后，体外酶活实验证实其能以二氢槲皮素和二氢山柰酚为底物，分别生成无色花青素和无色天竺葵素，但不能还原二氢杨梅素；同时发现该酶具有黄烷酮4-还原酶活性，可将圣草酚转化为luteoforol，表现出DFR与FNR双重催化功能。实时定量PCR显示SmDFR在花中表达量最高，为叶片的8.31倍。该研究首次表征了水母雪莲DFR基因的生化功能与表达模式，为解析该类黄酮生物合成途径及通过基因工程提高活性成分含量奠定了基础。
创新点
['首次克隆并表征了水母雪莲的DFR基因（SmDFR）', '发现SmDFR不能以二氢杨梅素（DHM）为底物，但具有黄烷酮4-还原酶（FNR）活性，可将圣草酚转化为luteoforol', '通过酶活实验证实SmDFR偏好还原二氢槲皮素（DHQ）和二氢山柰酚（DHK），与红愈伤组织中主要积累花青素衍生物的结论一致']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 类黄酮生物合成途径 | SmDFR | 二氢黄酮醇4-还原酶 (DFR) | 催化 | 异源表达系统，证实SmDFR能还原DHQ和DHK，不能还原DHM，并具有FNR活性 |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli DH5α) | 无 | SmDFR | 二氢黄酮醇4-还原酶 (DFR) | 催化 | 用于pYES2重组质粒的克隆与扩增 |
| 水母雪莲 (Saussurea medusa) | 类黄酮生物合成途径 | SmDFR | 二氢黄酮醇4-还原酶 (DFR) | 催化 | 基因来源植物，其红色愈伤组织用于cDNA文库构建；组织表达分析显示花中表达最高 |
关键发现
['SmDFR cDNA全长1166 bp，包含1029 bp开放阅读框（ORF），编码342个氨基酸，预测分子量约38.6 kDa', 'SmDFR基因组DNA长1871 bp，包含6个外显子和5个内含子', 'SmDFR与同科植物斑点矢车菊DFR（CmDFR）氨基酸序列一致性高达91%，与其他菊科植物DFR一致性为85%–87%', '实时定量PCR显示，花中SmDFR表达量是叶片的8.31倍，根中表达量低于叶片', '酶活实验表明SmDFR能以二氢槲皮素（DHQ）生成无色花青素（leucocyanidin，m/z=287）、以二氢山柰酚（DHK）生成无色天竺葵素（leucopelargonidin，m/z=271），但不能还原二氢杨梅素（DHM）', 'SmDFR具有FNR活性，能以圣草酚（eriodictyol）为底物生成luteoforol（m/z=271）']
研究结论
成功克隆并表征了水母雪莲中一个新的DFR基因SmDFR，其属于植物DFR超家族，具有DFR和FNR双重催化活性，且在花中高表达。该研究为阐明水母雪莲类黄酮生物合成途径提供了重要依据，也为通过基因工程提高其类黄酮含量和改善人类健康奠定了基础