Stable plastid transformation in lettuce (Lactuca sativa L.)
- 作者
- Cilia L.C. Lelivelt, Matthew S. McCabe, Christine A. Newell, C. Bastiaan de Snoo, Kees M.P. van Dun, Ian Birch-Machin, John C. Gray, Kingston H.G. Mills, Jacqueline M. Nugent
- 单位
- Rijk Zwaan Breeding B.V.; Institute of Bioengineering and Agroecology National University of Ireland, Maynooth; Department of Plant Sciences, University of Cambridge; Department of Biochemistry, Trinity College; Department of Anatomy, University of Cambridge
- 杂志
- Plant Molecular Biology（2005）
- DOI
- 10.1007/s11103-005-7704-8
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在生菜（Lactuca sativa L.）中建立稳定的质体转化系统，以获得可育、同质化的转质体植株，并评估生菜质体作为人类治疗蛋白生产和递送系统的潜力。
研究策略
采用PEG介导的原生质体转化方法，利用靶向生菜质体基因组trnI/trnA间隔区的同源重组载体，以aadA基因作为壮观霉素抗性筛选标记；构建GFP/aadA和LEC1（aadA/HA）双顺反子表达盒验证转化系统。
核心内容
该研究首次在生菜中建立了稳定的质体转化系统。研究者采用PEG介导的原生质体转化方法，利用靶向trnI/trnA间隔区的同源重组载体，以aadA基因作为壮观霉素抗性筛选标记，并构建了GFP/aadA和LEC1（aadA/HA）双顺反子表达盒进行验证。从5.6×10⁶个可存活原生质体中再生出9个抗性细胞系，转化频率约为1-2个抗性细胞系/10⁶个原生质体，且所有抗性克隆均为真实质体转化体。GFP积累量约为总可溶蛋白的1%，低于烟草中类似构建的5.5%。LEC1转化获得3个再生株系，其中2个二倍体可育并结籽。自花授粉后代在含500 mg/l壮观霉素的培养基上100%为绿色抗性幼苗，而用雄性不育野生型授粉的1200粒种子全部白化敏感，证明质体转基因通过母系遗传且不通过花粉传递。Southern blot证实T1植株完全同质化。研究还发现烟草的rrn启动子和psbA 3'UTR可在生菜质体中驱动转基因表达，但外源蛋白积累水平需通过优化表达盒设计进一步提升。该工作为利用可食用生菜质体生产人类治疗蛋白奠定了基础。
创新点
首次在生菜（菊科）中获得可育、同质化的转质体植株；证明烟草的基因调控序列（如rrn启动子和psbA 3'UTR）可在生菜质体中驱动转基因表达；建立的PEG原生质体转化系统获得的抗性克隆100%为真实质体转化体（对比烟草中13-55%为假转化体）。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 生菜（Lactuca sativa L.）cv. Flora | 质体基因组（叶绿体） | aadA | 氨基糖苷类3''-腺苷酰转移酶 | 催化 | 壮观霉素抗性选择标记，通过催化壮观霉素腺苷酰化使细胞产生抗性 |
| 生菜（Lactuca sativa L.）cv. Flora | 质体基因组（叶绿体） | gfp | 绿色荧光蛋白 | 催化 | 报告基因，GFP生色团自催化形成并发射荧光，用于检测质体转化及定位 |
| 生菜（Lactuca sativa L.）cv. Flora | 质体基因组（叶绿体） | HA | 流感病毒血凝素 | 调控 | 候选疫苗抗原基因，检测到转录但未检测到蛋白积累 |
| 生菜（Lactuca sativa L.）cv. Flora | rrn操纵子（trnI/trnA间隔区） | trnI, trnA | tRNA-Ile, tRNA-Ala | 调控 | 质体基因组中的同源重组靶位点，用于外源基因定点整合 |
| 生菜（Lactuca sativa L.）cv. Flora | 质体基因表达 | Prrn（烟草rrn启动子） | 无 | 调控 | 用于驱动aadA和gfp表达的启动子，具有核糖体结合位点 |
| 生菜（Lactuca sativa L.）cv. Flora | 质体基因表达 | PLs-rrn（生菜rrn启动子） | 无 | 调控 | 用于LEC1双顺反子表达盒的启动子，驱动aadA和HA共转录 |
| 生菜（Lactuca sativa L.）cv. Flora | 质体基因表达 | psbA 3'UTR | 无 | 调控 | 用于稳定mRNA的3'非翻译区，来自烟草或生菜psbA基因 |
关键发现
- 从总共5.6×10^6个可存活原生质体中再生出9个壮观霉素抗性细胞系，转化频率估计为1-2个抗性细胞系/10^6个原生质体
- GFP/aadA-2.2愈伤组织系中GFP积累量约为总可溶蛋白（TSP）的1%，低于烟草中类似构建的5.5% TSP
- 7个检测细胞系中2个表达GFP，2个非表达系经测序证实为通过重复Prrn序列重组发生gfp基因切除
- LEC1转化获得3个再生株系，其中2个二倍体（LEC1-2.2和3.1）可育并结籽，1个四倍体不育
- 自花授粉的LEC1-2.2再生株系的种子在含500 mg/l壮观霉素的培养基上100%为绿色抗性幼苗，而用雄性不育野生型授粉的1200粒种子100%白化敏感，证明质体转基因母系遗传且不通过花粉传递
- Southern blot证实T1植株中仅含13.1 kb杂合条带而无9.9 kb野生型条带，表明完全同质化
- Northern blot检测到3.2 kb的aadA/HA双顺反子转录本，但未检测到HA蛋白积累
- 生菜trnI和trnA基因与烟草相比分别有231 bp和101 bp的额外序列
- 所有获得壮观霉素抗性的生菜细胞系均为真正质体转化体，未观察到自发突变或核转化体。
研究结论
成功建立了生菜PEG介导的质体转化系统，获得可育、同质化且可母系遗传的转质体植株。生菜质体可作为人类治疗蛋白（如亚单位疫苗）的生产与递送平台，但需要优化外源蛋白表达盒设计（如5'UTR、N端融合等）以促进蛋白积累。